通络驻景丸对糖尿病大鼠视网膜的保护作用研究

雷晓琴，李高彪，周云云，李雨薇，任翠翠，艾华

氧化应激反应在糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)的病程中发挥着极其重要的作用，高血糖或糖尿病(diabetes mellitus，DM)时增强的氧化应激反应能使视网膜受损[1]。核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反应元件 (antioxidant response element，ARE)信号通路是目前发现的最重要的内源性抗氧化应激通路，在氧化应激相关组织损伤中发挥重要作用[2]。Nrf2转入细胞核和ARE结合进而调控血红素氧合酶1(HO-1)等下游抗氧化基因转录，进而发挥抗氧化损伤和抑制视网膜增殖等作用[3]。血管内皮生长因子(VEGF)可促进视网膜血管内皮细胞增殖，是目前发现的促使DR新生血管形成的最主要因子[4-5]。课题组前期研究表明通络驻景丸对糖尿病大鼠视网膜病变氧化应激、炎症因子的高表达具有明显抑制作用[6-7]。本研究在前期研究的基础上，以Nrf2/ARE通路为切入点，观察通络驻景丸对DM大鼠视网膜组织中Nrf2、HO-1、VEGF表达的影响，探讨通络驻景丸对DM大鼠视网膜的保护作用及其作用机制。

1　材料与方法

1.1　实验动物

SPF级SD大鼠，体重(200±20)g，饲养于西安交通大学医学部实验动物中心清洁级动物房。适应性喂养7天，除空白组（NC组）大鼠20只，其余用STZ腹腔注射造成DM动物模型。将STZ按1%浓度溶解于新配柠檬酸缓冲溶液中，按60 mg/kg注射制备DM大鼠，给予NC组大鼠相同体质量的上述缓冲液。造模成功的大鼠40只随机均分为模型组（DM组）、通络驻景丸组（TLZJ组）。NC组、DM组给予蒸馏水，TLZJ组给予通络驻景丸，按临床等效剂量的10倍灌胃，1次/日，共12周。

1.2　药物、试剂和仪器

链脲佐菌素（Sigma公司）。通络驻景丸（由熟地黄，车前子，菟丝子，墨旱莲，蒲黄，三七，地龙等组成），4 g/袋，由西安交通大学医学部药学院提供，实验时用蒸馏水配置成所需浓度的混悬液；兔抗大鼠Nrf2、HO-1、VEGF 单 克隆抗 体 (CST 公司)；Nrf2、HO-1、VEGF、GAPDH引物序列 (西安热默尔生物科技有限公司)；提取总RNA试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR green PCR试剂盒(ABI公司)；紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；实时定量PCR仪（Takara公司）。

1.3　大鼠视器组织标本制备

将NC组、DM组、TLZJ组大鼠各组均分为2组，分别于成模后6周和12周收集心脏血液备用，同时取大鼠视器，两时间点分别任取各组10只视器制成石蜡切片标本。分别取各组两时间点剩余视器的视网膜并在PBS中漂洗，立即放于液氮中备用。

1.4　免疫组织化学法检测大鼠视网膜中Nrf2、HO-1、VEGF蛋白的表达量

取3组各时间点的石蜡切片，应用免疫组织化学染色法， 兔抗大鼠 Nrf2(1∶100)、HO-1(1∶100)、VEGF(1∶100)。脱蜡、水化、抗原修复、漂洗 5 min、PBS洗涤；加一抗，4℃，过夜；PBS 洗涤，加二抗，孵 2 h，PBS洗涤，DAB显色，流水冲洗；苏木素染色，流水洗10 min；脱水、透明、封片。光镜下观察，并测定单位面积吸光度(IA)。

1.5　RT-PCR检测大鼠视网膜中Nrf2、HO-1、VEGF mRNA的表达量

Nrf2、HO-1、VEGF、引物序列分别为 107 bp、129 bp、182 bp。取各组视网膜。Trizol一步法提取总RNA。反转录反应体系：总RNA、OligodT、逆转录酶、dNTP、5 × Buffer 各 3 μg、1 μL、0.5 μL、1 μL、4 μL，加 DEPC 水至 20 μL；反应条件：45℃ 60 min，95℃ 5 min。反应结束后-20℃保存。扩增反应体系：cDNA、上游引物、下游引物、2×SYBR GreenⅠ、2×mix各1 μL、0.5 μL、0.5 μL、1 μL、12.5 μL， 加 DEPC 水至25 μL。 反应步骤：94℃ 330 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共32循环。以GAPDH作为内参照，计算Nrf2、HO-1、VEGF mRNA的相对表达量。

1.6　统计学分析

应用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析。所有计量资料符合正态分布，采用均数±标准差(x¯±s)表示；应用单因素方差分析对计量资料进行处理，析因方差分析用于不同处理因素和时间对测量指标的影响，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠视网膜组织中Nrf2、HO-1和VEGF蛋白相对表达量

6 周和 12 周时，DM 组 Nrf2、HO-1、VEGF 表达量明显高于NC组，差异均有统计学意义(P值均为0.000，P＜0.05)，TLZJ 组 Nrf2、HO-1 表达量高于 DM组，VEGF的表达量较DM组降低，差异均有统计学意义(P 值均为 0.000，P＜0.05)。12周与 6周比较，DM组HO-1表达量较6周降低，Nrf2、VEGF的表达量较6周增加，差异均有统计学意义(P值均为0.000，P＜0.05)；TLZJ组 Nrf2、HO-1 表达量较 6 周增加，VEGF的表达量较6周减少，差异均有统计学意义(P值均为 0.000，P＜0.05)。 见表 1

2.2　各组大鼠视网膜中 Nrf2、HO-1、VEGF mRNA的相对表达量

6 周和 12 周时，DM 组 Nrf2、HO-1、VEGF mRNA的表达量明显高于NC组，差异均有统计学意义(P 值均为 0.000，P＜0.05)，TLZJ组 Nrf2、HO-1 mRNA的表达量高于DM组，VEGF mRNA的表达量较DM组降低，差异均有统计学意义 (P值均为0.000，P＜0.05)。12周与6周比较，DM组HO-1 mRNA表达量较6周减少，Nrf2、VEGF mRNA的表达量增加，差异均有统计学意义 (P值均为 0.000，P＜0.05)；TLZJ组Nrf2、HO-1 mRNA的表达量较6周增加，VEGF的表达量减少，差异均有统计学意义(P值均为0.000，P＜0.05)，见表 2。

3　讨论

糖尿病视网膜病变（DR）属中医学“消渴目病”范畴，中医理论认为肝肾不足，湿浊瘀血阻络是DR的关键病机，通络驻景丸是在古方驻景丸的基础上增加墨旱莲，蒲黄，三七，砂仁，地龙而创制，具有补益肝肾，滋阴泻浊，通络明目之功，是治疗DR的临床经验方，临床疗效确切[8-10]。DR发病过程中，体内可产生过多的活性氧簇(ROS)，导致视网膜氧化应激损伤，Nrf2/ARE通路是调控机体氧化还原反应的关键通路，激活时可促使抗氧化蛋白因子表达增强，减轻氧化应激损伤[11-13]。研究表明[14]，DM早期大鼠自身能够对抗高糖环境引发的ROS增多，20周时，DM大鼠抗氧化应激损伤能力受损，发生氧化应激损伤。本研究结果显示，6周时，DM 组 Nrf2、HO-1、VEGF表达较NC组增多；12周时，DM组HO-1的表达较6周时降低，VEGF的表达增强。说明DM早期，Nrf2/ARE通路被激活，促使DM大鼠视网膜Nrf2、HO-1表达增强，可减轻视网膜氧化应激反应；到12周时，HO-1表达量降低，说明此时DM大鼠出现氧化应激损伤；由于VEGF是视网膜缺血缺氧时产生的促新生血管生成的重要因子[4-5]，12周时VEGF表达较6周增加，说明随着氧化应激损伤的加重，DM大鼠视网膜组织缺血缺氧和视网膜增殖也在加重。

表1　各组大鼠视网膜中Nrf2、HO-1和VEGF蛋白相对表达量的比较(x¯±s,n=10)

表2　各组大鼠视网膜中Nrf2、HO-1和VEGF mRNA相对表达量的比较(x¯±s，n=10)

通络驻景丸干预6周时，与DM组相比，大鼠视网膜组织中Nrf2、HO-1表达增强；12周时，TLZJ组大鼠视网膜组织中Nrf2、HO-1表达较6周时进一步增强，说明通络驻景丸可有效促使DM大鼠视网膜组织中Nrf2、HO-1的表达，通络驻景丸可通过Nrf2/HO-1途径增强DM大鼠视网膜抗氧化应激损伤能力。

12周和6周相比，TLZJ组大鼠视网膜VEGF的表达较DM组显著下降，可能与HO-1等抗氧化因子表达增强，减轻视网膜氧化应激损伤和改善视网膜组织缺血缺氧有关，说明通络驻景丸能有效改善视网膜增殖，可通过Nrf2/HO-1/VEGF途径发挥抑制视网膜新生血管的作用；6周时，TLZJ组VEGF的表达较NC组增加且有统计学意义，12周时TLZJ组VEGF的表达较6周时减少，且和NC组相比无统计学意义，说明通络驻景丸抑制视网膜增殖作用随干预时间的增加在增强。通络驻景丸可能是通过促进Nrf2入核与ARE结合，激活Nrf2-ARE信号通路，促使抗氧化基因HO-1的表达，进而降低VEGF表达，发挥对DM大鼠视网膜的保护作用。