马铃薯块茎花色素苷合成相关R2R3 MYB蛋白基因的克隆和功能分析

谈 欢 刘玉汇,* 李丽霞 王 丽 李元铭 张俊莲,*

1 甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室 / 甘肃农业大学园艺学院 / 甘肃省干旱生境作物学重点实验室, 甘肃兰州 730070;

2甘肃农业大学生命科学技术学院, 甘肃兰州 730070

花色素苷是一类以花色基元为基本结构的水溶性色素, 主要分为飞燕草色素、芍药色素和天竺葵色素等[1]。它们不仅可以使植物呈现出不同的色彩,还有助于昆虫的传粉、植物生长素的运输以及保护叶片免受紫外线损伤, 同时具有抑制病虫害等重要的作用。此外, 它还具有抗癌、抗氧化等保健作用和药用价值[2], 因此近年来备受人们的关注。

花色素苷是类黄酮类次生代谢物质, 合成前体为苯丙氨酸。苯丙氨酸经苯丙氨酸裂解酶(PAL)、查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮-3-羟基化酶(F3H)、黄烷酮-3'-羟基化酶(F3'H)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)、花色素苷合成酶(ANS)或无色花色素双加氧酶(LDOX)形成不稳定的花色素苷, 再经类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶(UFGT)催化生成稳定的花色素苷[3-4]。研究证实, 参与花色素苷合成的调控因子包括R2R3 MYB蛋白、bHLH蛋白和WD40蛋白三大类转录因子, 其中R2R3 MYB为最重要的转录因子, 其调控花色素苷合成已在苹果和葡萄上证实[5-6]。R2R3 MYB中R2和R3基序能够特异性识别DNA序列, R3 C端的螺旋结构能特异结合目标基因启动子区顺式作用元件中的核心序列[7]。植物bHLH转录因子能调控花器官发育和激素应答等[8-9],其最重要的功能是调节类黄酮和花色素苷的合成。

R2R3 MYB蛋白调控植物花色素苷的合成已在果树[10]、小麦[11]、拟南芥[12]、甘蔗[13]等植物中报道, 例如, 苹果R2R3 MYB蛋白中的MdMYB10使DFR基因表达量上调[14], MdMYBA使ANS的转录水平提高[15], MdMYB1激活结构基因UFGT和DFR,从而提高了苹果花色素苷的含量[16]; 油桃中分离的MYB10能够正向调控DFR基因的表达, 促进花青素在果实中大量积累[17]; 拟南芥 AtMYB75转录因子调控花色素苷的生物合成, 其异位表达促进类黄酮类物质生物合成相关基因的表达, 导致植物的大多数器官呈现紫色[18-20]。

马铃薯中有 117个 MYB类转录因子, 其中R2R3型MYB数量最多, 它参与植物次生代谢调控、激素刺激和环境胁迫应答等过程[21], R2R3 MYB转录因子能够调控马铃薯薯皮和叶片中花色素苷合成途径结构基因的表达, 从而促进花色素苷的积累[22-23]。生物或非生物因素均能影响花色素苷的生物合成,光照强度与StCHS、StDFR和StR2R3-MYB的表达正相关; 环境温度与StPAL、StDFR和StR2R3-MYB的表达负相关[24-28]。本试验以彩色四倍体马铃薯为研究对象, 分离了3个马铃薯R2R3 MYB基因, 并以烟草为受体进行稳定遗传转化, 利用 qPCR进行转基因烟草叶片中与花色素苷合成相关基因和转录因子的相对表达分析, 并分析 3个同源基因的功能。本研究为进一步探究马铃薯块茎花色素苷合成的调控机制以及人工调控马铃薯块茎花色素苷合成提供理论和方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试剂

马铃薯品种 “新大坪”(XD: 白皮白肉)、“黑美人”(HM: 紫皮紫肉)、“甘农薯5号”(GN: 红皮白肉)和“青薯9号”(QS: 红皮白肉, 红色的维管束), 均在甘肃农业大学温室内种植。其中 GN由甘肃农业大学培育, HM和XD是甘肃省当地栽培品种, QS由青海省农林科学院培育。分别在块茎收获期采集 4个品种薯皮和薯肉, 立即放入液氮速冻, 于–80℃冰箱保存备用。野生型烟草由甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室提供。

大肠杆菌 DH5α感受态细胞和 pGEM-T Easy Vector载体(抗性标记为氨苄青霉素)购自 Promega公司; 限制性内切酶、T4 DNA连接酶和TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司; PureLink Plant RNA Reagent Kit购自 Invitrogen公司; QuantiTect Reverse Transcription Kit购自Qiagen公司; DNA凝胶回收试剂盒购自北京天根公司; 其他生化试剂均为国产分析纯。

1.2 3个StAN1基因编码序列的克隆

将已报道的马铃薯StAN1的基因序列(AY841129)作为参考序列[29], 利用Oligo6设计引物StAN1-F (5′-ATGAGTACTCCTATGATGTGTA- 3′)和StAN1-R (5′-CTAATTAAGTAGATTCCATATATC-3′),克隆4个品种StAN1基因的编码序列。用PureLink Plant RNA Reagent Kit试剂盒分别抽提4种马铃薯薯皮薯肉的总RNA。用Nanodrop ND-1000分光光度计(Thermofisher公司, 美国)测定 RNA纯度和浓度, 并用 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。利用QuantiTect Reverse Transcription Kit试剂盒进行反转录, 其中以Oligo(dT)20为引物, 在M-MLV反转录酶作用下合成cDNA第1链, 并在–20℃下保存。

PCR反应体系是由cDNA模板2 µL、10×buffer 2.5 µL、10 mmol L–1的上下游引物各 1 µL、TaqDNA聚合酶0.5 µL、ddH2O 18 µL组成。反应程序为94℃预变性5 min; 94℃变性50 s, 57℃退火50 s, 72℃延伸1 min, 35个循环; 72℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

将扩增得到的目的片段用琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化, 并分别与 pGEM-T Easy Vector载体连接,转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞, 对所获得的白斑通过滞后质粒、PCR扩增、EcoR I酶切鉴定后, 于–80℃下保存, 并将阳性克隆送到生工生物工程(上海)有限公司进行DNA测序验证。

1.3 马铃薯 StAN1转录因子家族成员的生物信息学分析

用在线软件 Expasy (http://au.expasy.org/tools/)中提供的ProtParam和ProtScale分别进行蛋白质分子式、分子量、等电点、脂肪系数、不稳定系数和氨基酸亲疏水性的分析, 用 SOPMA (https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsaautomat.pl?page=npsa_sopma.html)预测蛋白质的二级结构。使用在线分析软件InterPro: protein sequence analysis & classification(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)进行保守性功能域分析。

以StAN1-R0为参比序列, 通过NCBI在线比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), 找出与其同源性较高的其他物种的氨基酸序列, 通过Clustal X2和 DNAMAN软件进行氨基酸序列比对, 利用MEGA5.0软件构建系统进化树。

1.4 农杆菌介导叶盘法共转化烟草及表达分析

利用EcoR I酶切位点将StAN13个同源基因的全长片段重组到植物表达载体pSAK277中, 再将构建体转入农杆菌。使用农杆菌介导叶盘法[30]将StAN1-R0、StAN1-R1和StAN1-R3基因转化到野生型烟草中, 通过 Kan抗性筛选和颜色判定初步筛选阳性抗性苗。根据特异性引物(F1: 5′-GGCCACATATC AAGAGAGGTGACTTTG-3′, R1: 3′-TCACATCGTT AGCTGTCCTTCCTGG-5′)对所对应的目的基因进行PCR扩增鉴定, 分别用1.5%琼脂糖电泳检测扩增产物, 根据鉴定结果最终获得转StAN1-R0、StAN1-R1和StAN1-R3基因的烟草株系分别为6、9和7株。

1.5 利用qPCR分析转基因烟草中MYB基因的相对表达

分别提取转StAN1-R0、 StAN1-R1和StAN1-R3基因烟草叶片的总RNA, 反转录获得的cDNA作为qPCR扩增模板, 根据特异性设计qPCR引物(表1)。以NtEF-1α基因(序列号为 D63396)为内参, 在Mx3005p型实时荧光定量PCR仪中进行定量分析。反应体系包含浓度为 50 ng µL–1的 cDNA 2.0 µL、上下游引物 0.4 µL、Nuclease-Free Water 7.2 µL 和 GoTaqqPCR Master Mix 10 µL。反应程序为95℃预变性5 min; 95℃变性5 s, 60℃退火5 s, 72℃延伸10 s,循环 40次。每个样品重复 3次, 反应结束后采用2–ΔΔCT[31]法分析数据。

1.6 转基因烟草中花色素苷平均含量的分析

将不同转基因烟草叶片样品在液氮中充分研磨,取0.5 g转至5 mL的离心管, 加入酸性甲醇提取液至满管, 混匀, 4℃下黑暗放置24 h, 离心, 上清液转入 25 mL的容量瓶, 残渣中加入酸性甲醇提取液,悬浮混匀, 4℃下黑暗放置12 h, 离心取上清液。重复以上步骤 1次, 最后将浸提液定容至 25 mL。在400～800 nm 可见光的波长范围内进行紫外-可见光吸收光谱的扫描, 确定其在可见光区的最大吸收波长。取1 mL花色苷提取液, 分别加入pH 1.0氯化钾缓冲液和pH 4.5醋酸钠缓冲液9 mL, 室温平衡1 h,蒸馏水做空白对照, 分别在λmax和λ700下测定吸光值,代入公式计算花色素苷总含量[32-33], 最后求其花色素苷含量平均值。

2 结果与分析

2.1 StAN1基因序列的克隆和分析

从图1可以看出, 总RNA的28S和18S条带完整、清晰, 表明RNA的完整性良好。

以cDNA为模板, 通过PCR扩增, 从4个马铃薯品种的薯皮和薯肉中分别获得了长度为735、777和837 bp的完整片段(图2)。根据C端10个氨基酸序列组成的重复结构(R: TIAPQPQEGI)数目的不同(图3), 分别命名为StAN1-R0、StAN1-R1和StAN1-R3(GenBank登录号依次为AKA95391、AKA95392和AKA95392)。其中在WS中含有StAN1-R0, WF中含有StAN1-R1; PS和PF只含有StAN1-R1; RS1、RS2、WF1、WF2和WFV中含有StAN1-R3。序列比对分析发现这 3个序列间的同源性达到 88.85%。StAN1-R0、StAN1-R1、StAN1-R3与参考序列(AY841129)的同源性分别为 87.98%、94.57%和90.29%;StAN1-R0与StAN1-R1、StAN1-R3的同源性分别为 89.15%和 82.37%;StAN1-R1与StAN1-R3的同源性为89.57%, 二者同源性最高。

表1 定量PCR分析的引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR in this study

图1 总RNA的电泳图Fig. 1 Electrophoresis of the total RNA

2.2 马铃薯StAN1基因的生物信息学分析

2.2.1 马铃薯StAN1基因编码蛋白质的一级结构预测 通过在线工具ExPASy中的ProtParam预测马铃薯StAN1基因编码蛋白质的一级结构, 蛋白质分子式分别为 C1227H1936N362O365S14、C1284H2019N377 O390S15和 C1371H2164N402O423S15, 分子量分别为28 047.91、29 458.35和 31 527.60 Da。等电点(pI)分别为8.39、6.90和6.14, 等电点的差异表明, 3个同源基因与其他植物的MYB基因在编码蛋白质稳定性、功能或者调控方式上有所差异[34]。3个蛋白质分别有负电荷残基(Asp+Glu) 30、32和34个, 正电荷残基(Arg+Lys) 33、32和32个。蛋白质三维结构不

图2 基因克隆过程的PCR产物电泳图Fig. 2 PCR map of gene cloning

图3 序列比对图Fig. 3 Sequence comparison chart

稳定系数(II)分别为46.97、48.64和50.76, 平均疏水性(GRAVY)分别为-0.693、-0.720 和-0.712, 脂肪系数分别为(AI)为79.14、74.88和76.15。蛋白质不稳定系数均大于40, 三者表现为不稳定状态[35](表2)。

2.2.2 马铃薯StAN1基因编码蛋白质的疏水性/亲水性的预测和分析 蛋白质的疏水性可根据蛋白质的平均疏水性(GRAVY)值来预测, 当 GRAVY 大于 0时, 为疏水蛋白; 当GRAVY小于0时, 为亲水蛋白[36]。

根据 ProtScale软件预测, 三者的平均疏水性GRAVY均小于0 (表2), 故推测马铃薯R2R3 MYB蛋白均为亲水蛋白。

2.2.3 马铃薯StAN1基因编码蛋白质的二级结构的预测和分析 根据SOPMA软件预测, 3种马铃薯StAN1基因编码的蛋白质均由α-螺旋、β-螺旋、无规则卷曲和延伸链组成。3个蛋白均为无规则卷曲＞α-螺旋＞延伸链＞β-螺旋(表 3)。

表2 马铃薯StAN1基因编码蛋白质的一级结构预测Table 2 Primary structure prediction of potato StAN1 gene encoding proteins

表3 StAN1基因编码蛋白质的二级结构分析Table 3 Secondary structure analysis of StAN1 gene encoding protein (%)

2.2.4 马铃薯StANI-R0、StANI-R1和StANI-R3氨基酸同源性分析 多重序列比对结果显示, 这 3个同源基因的编码区均含高度保守的R2和R3 MYB结构域, 分别由48个和46个氨基酸组成, 该结构域与来自茄科植物和其他科属植物 MYB转录因子的保守结构域具有很高的同源性(图4)。系统进化分析表明, 与StAN1-R0智利番茄和多毛番茄同源基因相似性最高, 同源性为 53.0%; 与单子叶植物玉米和水稻同源基因相似性较低, 分别为33.2%和29.3% (图5)。

2.2.5 转StAN1基因烟草的鉴定及其花色素苷平均含量的分析 转目的基因StAN1的烟草叶片颜色呈现红色, 而CK的叶片为绿色, 转基因烟草的叶片和叶脉颜色深度分别为StAN1-R1＞StAN1-R0＞StAN1-R3(图 6-a, b)。对转基因烟草植株进行目的基因的PCR鉴定, 结果进一步证实 3个目的基因已成功转入野生型烟草中(图7)。分别取转StAN1基因烟草和CK各3个株系的叶片测定花色素苷的含量发现, 转基因烟草叶片的花色素苷含量均明显高于CK, 且3个转基因烟草之间的花色素苷含量差异显著(图 8),转StAN1-R1烟草叶片中花色素苷平均含量最高, 为

124.46 mg g–1FW,StAN1-R3中平均含量最低, 为89.51 mg g–1FW, 与表型相一致。

2.2.6 转基因烟草中花色素苷合成关键基因的表达分析 从图9-A可以看出, 外源基因StAN1在转基因烟草中显著上调表达, 且 3个基因的表达量之间无显著差异, 而在对照烟草中检测不到StAN1, 进一步说明外源基因StAN1已导入到烟草中。与 CK相比, 转StAN1-R0、StAN1-R1和StAN1-R3基因烟草中参与花色素苷合成的相关基因表达量大幅上调,包括合成途径中的早期表达基因NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtF3’H和晚期表达基因NtDFR、NtANS、NtUFGT。其中NtDFR和NtANS在转StAN1-R1烟草中的表达量显著高于转StAN1-R0和StAN1-R3烟草中的。此外, 与CK相比, 转StAN1-R0,StAN1-R1和StAN1-R3烟草叶片中内源 NtbHLH转录因子(NtAN1a和NtAN1b)的相对表达量均大幅度上调(图9-B～I), 说明 3个目的基因的转入显著增强了NtbHLH基因的表达, 其中StAN1-R1对其调控能力最强, StAN1-R3的调控能力最弱, StAN1-R0的调控能力介于两者之间。

图4 一些茄科植物与其他科属植物的R2R3 MYB氨基酸序列多重比对Fig. 4 Multiple alignment of amino acid sequence of R2R3 MYB in some solanaceae plants and other subfamily

3 讨论

四倍体马铃薯的栽培种遗传背景复杂, 不同品种的彩色马铃薯所合成花色素苷的种类和数量也不同。MYB是参与调控植物花色素苷合成中涉及最广泛的转录因子, 研究者已在多种植物中克隆分离出大量的与花色素苷合成积累有关的 MYB转录因子,且对其研究较为深入[37]。植物 MYB蛋白的结构域高度保守, 该结构域通常包括 1～4个重复的氨基酸R基序, 根据R基序的数量分为R1 MYB蛋白、R2R3 MYB蛋白、R1R2R3 MYB蛋白和4R MYB蛋白[10],其中R2R3 MYB在参与调控不同植物以及同种植物不同组织器官中的花色素苷合成与积累中尤为重要[38]。研究发现, 在马铃薯红色薯皮和紫色薯皮中表达的基因D是二倍体马铃薯薯皮花色素苷合成的转录调控基因, 其编码 R2R3 MYB-StAN1转录因子[25]。StAN1不仅调控薯皮颜色, 而且与 StJAF13转录因子协同调控马铃薯红叶品种“Magenta Love”的叶片

颜色; 在另一个红叶品种‘Double Fun’中, StbHLH1转录因子与StAN1和StJAF13共同调控叶片颜色[23]。

图5 StAN1基因与一些茄科和其他植物R2R3 MYB转录因子家族氨基酸序列的系统进化树分析Fig. 5 Phylogenetic tree analysis of the amino acid sequence of StAN1 genes and some R2R3 MYB transcription factor families in solanaceae and other plants

图6 转StAN1基因烟草的表型分析Fig. 6 Phenotypic analysis of StAN1 transgenic tobaccoa: 转StAN1基因烟草的整株; b: 转StAN1基因烟草的叶片。a: whole plant of StAN1 transgenic tobacco; b: leaves of StAN1 transgenic tobacco.

图7 转StAN1基因烟草的PCR鉴定Fig. 7 PCR identification of StAN1 transgenic tobacco

图8 转StAN1基因烟草与对照的花色素苷平均含量Fig. 8 Average content of anthocyanin in StAN1 transgenictobacco and control

本实验从不同颜色的四倍体马铃薯块茎中克隆分离了StAN1的 3个同源基因, 通过序列比对分析发现其区别在于 C末端 3个重复序列数目(R)不同,根据 R数目分别命名为StAN1-R0、StAN1-R1和StAN1-R3。通过进一步转化烟草分析发现,StAN1-R0、StAN1-R1以及StAN1-R3均显著调控烟草叶片花色素苷合成相关的结构基因, 使烟草叶片明显积累花色素苷从而呈现红色, 其中含有一个重复序列R的StAN1-R1调控能力最强, 烟草叶片呈现深红色, 花色素苷含量积累最多, StAN1-R3调控能力最弱, 说明R在StAN1调控花色素苷能力方面具有重要功能。

另有研究表明, MYB转录因子需要与其他转录因子结合协同调控花色素苷的合成[39-40]。本研究发现转StAN1-R0、StAN1-R1和StAN1-R3烟草叶片中NtbHLH基因显著上调表达, 说明外源基因StAN1导入烟草后可以激活烟草内源转录因子NtbHLH的表达, 其表达量在转StAN1-R1烟草中最高, 在转StAN1-R3烟草中最低, 与烟草叶片中花色素苷含量相一致, 因此推测 NtbHLH也是调控花色素苷合成的重要转录因子, StAN1与NtbHLH协同调控烟草叶片花色素苷的合成。

综上所述, StAN1转录因子调控花色素苷合成有两个重要机制, 一是 C末端结构不同的 3个StAN1同源蛋白调控花色素苷合成的能力不同, 其中含一个重复序列R的StAN1-R1调控能力最强, 说明 R具有重要功能; 二是 StAN1显著调控内源bHLH转录因子的表达, 推测其与bHLH转录因子协同调控花色素苷生物合成相关结构基因的表达, 从而促进花色素苷的合成与积累。

4 结论

本试验克隆了马铃薯R2R3 MYB家族的3个同源基因StAN1-R0、StAN1-R1和StAN1-R3。StAN1-R0的分子量最小, StAN1-R3分子量最大。3个同源基因编码的蛋白质均为不稳定状态, 二级结构均由 α-螺旋、β-螺旋、无规则卷曲和延伸链组成, 均含有2个高度保守结构域R2和R3。与StAN1基因同源性最高的为智利番茄和多毛番茄, 同源性最低的为玉米和水稻。叶色深度为StAN1-R1＞StAN1-R0＞StAN1-R3＞CK。花色素苷含量为StAN1-R1＞StAN1-R0＞StAN1-R3＞CK。StAN1的异源表达激活了烟草叶片内花色素苷合成的早期生物基因(NtCHS、NtCHI、NtF3H和NtF3’H)和晚期生物基因(NtDFR、NtANS和NtUFGT)的表达, 同时也显著增强了内源NtbHLH转录因子的表达, 其中, 含有一个R基序的StAN1-R1调控能力最强。本研究为更深入了解R2R3 MYB转录因子参与调控马铃薯块茎花色素苷合成提供了理论基础。