牦牛MT—3基因生物信息学分析

李洁 王建福

摘要：利用生物基因组学数据库，对牦牛金属硫蛋白3基因进行生物信息学分析，从而预测 MT-3 基因编码产物的理化性质以及功能结构域，并构建MT-3同源基因的系统进化树。结果表明，牦牛MT-3 基因含有1 个 513 bp 的ORF，编码 170 个氨基酸。MT-3蛋白分子质量约为17 556.37 Da，理论等电点为 5.68。MT-3 编码产物的二级结构主要以β折叠和无规则卷曲为主，推测是非酶类蛋白质。MT-3具有神经生长抑制活性，通过清除自由基和 NO ，从而起到保护脑细胞的作用。

关键词：牦牛；金属硫蛋白3基因；生物信息学分析

中图分类号：S826；Q57 文献标志码：A 文章编号：1001-1463（2018）02-0058-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.02.016

Bioinformatics Analysis of Wild Yak MT-3 Gene

LI Jie， WANG Jianfu

（College of Animal Science and Technology， Gansu Agricultural University， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：This study aimed to study the bio-information of Wild yak MT-3 gene. The physicochemical characteristics， structures and functions of ovine MT-3 are predicted with software tools and database. Meanwhile， the phylogenetic tree of MT-3 and related proteins is constructed， The results show that the ORF of MT-3 is 513 bp which encoded 170 amino acids. The Wild yak protein of MT-3 is 17 556.37 Da in molecular weight， isoelectric point is 5.68. The secondary structure of MT-3 shows that it is mainly constituted of β-pleated sheet and coils， the encoding production conjecturally belongs to non-enzyme protein. MT-3 has an inhibitory activity on nerve growth， by scavenging free radicals and NO， it plays a role in protecting brain cells.

Key words：Wild yak；Metallothionein 3 gene；Bioinformatics analysis

收稿日期：2017 - 09 - 28

基金项目：甘肃省农牧厅生物技术子课题（GNSW-2011-27）。

作者简介：李 洁（1982 — ），女，河南商丘人，实验师，主要从事动物遗传育种与繁殖工作。联系电话：（0931）7631225。E-mail：lijie@gsau.edu.cn。

通信作者：王建福（1982 — ）男，河南商丘人，讲师，主要从事水产养殖工作。联系电话：（0931）7631225。E-mail：wangjf@gsau.edu.cn。

定西市安定区位于甘肃省中部，北纬35° 17′54″至36° 02′ 40″，东经104° 12′ 48″至105° 01′06″，南北长82.9 km，东西宽73.3 km，海拔 1 700～2 580 m，属典型的黄土高原干旱半干旱雨养农业区，抗旱生产是安定区农业工作的重点。中晚熟玉米适宜海拔在2 000 m以下的区域种 植[1 ]，而安定区大面积耕地海拔在2 000 m以上，中晚熟品种很难成熟，全膜双垄沟播技术将玉米种植范围扩大到海拔2 100 m区域[2 - 3 ]。为了考察早熟玉米新品种在安定区高海拔区的适应性、抗逆性、生产稳定性，2017年安定区农业技术推广服务中心引进了7个早熟玉米新品种进行比较试验，以期筛选出适合当地海拔2 100 m以上区域生产应用的玉米品种。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试材料

参试玉米品种7个，其中武科早303、武科早304由武威市武科种业科技有限公司生产，甘玉804由甘肃种业有限责任公司生产，兴达1601、兴达1602由甘肃兴达种业有限公司生产，金穗606、金穗607及当地常规种植品种金穗3号（CK）由白银金穗种业有限公司生产。

1.2 试验地概况

试验设在定西市安定区团结镇小山村，海拔 2 150 m，年平均降水量430 mm，年蒸发量1 450 mm，无霜期141 d。前茬作物收获后深耕晒垡，冬前浅耕耙耱。采用全膜双壟沟播技术[4 ]，大垄宽70 cm、高10 cm，小垄宽40 cm、高15 cm。覆膜前结合整地一次性基施农家肥45 000 kg/hm2、玉米专用肥（N-P2O5-K2O为20-15-15）1 200 kg/hm2。用50%辛硫磷乳油7.5 kg/hm2加适量水喷拌细土450 kg制成毒土，撒施地面后起垄覆膜以防治地下害虫。用50%乙草胺乳油3 750 mL/hm2兑水600 kg喷洒于垄沟表面芽前除草。

1.3 试验方法

试验为随机区组设计，每品种为1个处理，3次重复，小区面积39.6 m2（11.0 m×3.6 m）。4月19日用玉米点播器播种，每穴2粒，播深4 cm，行距55 cm，株距30 cm，密度为60 000株/hm2。田间管理措施同当地大田。田间观察记载物候期及主要农艺性状，成熟后按小区抽样考种并单收计产。

2 结果与分析

2.1 生育期

从表1可以看出，各品种出苗期一致，均在5月2日。金穗607、武科早303、甘玉804、武科早304于6月中旬开始拔节，与金穗3号（CK）基本一致；兴达1601、金穗606、兴达1602拔节期较金穗3号（CK）迟13～16 d。抽雄期武科早303、武科早304均为 7月11日，较金穗3号（CK）早4 d；兴达1602与金穗3号（CK）一致；金穗606、兴达1601、甘玉804较金穗3号（CK）晚2 d。成熟期武科早303、武科早304、兴达1602最早，8月下旬已经成熟，较金穗3号（CK）早9 d；金穗607、甘玉804、兴达1601、金穗606均在9月上旬与金穗3号（CK）同期成熟。生育期武科早303、武科早304、兴达1602均为117 d，较金穗3号（CK）短9 d；其他品种生育期为126 d，与金穗3号（CK）相同。

2 主要性状

由表2可见，株高以金穗607、甘玉804、兴达1601最高，均为 2.5 m，较金穗3号（CK）高出0.5 m；武科早304、金穗606次之，均为2.4 m，较金穗3号（CK）高出0.4 m；武科早303、兴达1602最低，为1.7 m，较金穗3号（CK）低0.3 cm。穗位以甘玉804、金穗606最高，为80.0 cm，较金穗3号（CK）高12.5 cm；金穗607次之，为73.0 cm，较金穗3号（CK）高5.5 cm；武科早303最低，为36.5 cm，较金穗3号（CK）低31.0 cm。穗长以兴达1601最长，为23.0 cm，较金穗3号（CK）长5.0 cm；其次为甘玉804，为21.5 cm，较金穗3号（CK）长3.5 cm；武科早304最短，为17.5 cm，较金穗3号（CK）短0.5 cm；其他品种较金穗3号（CK）长0.5～2.0 cm。穗粗以金穗606最粗，为15.6 cm，较金穗3号（CK）粗0.1 cm，其他品种较金穗3号（CK）细0.2～2.3 cm。轴粗以武科早304最粗，为10.8 cm，较金穗3号（CK）粗0.8 cm；其次是金穗606，为10.3 cm，较金穗3号（CK）粗0.3 cm；其他品种较金穗3号（CK）细0.3～0.7 cm。粒型武科早304、兴达1602与金穗3号（CK）一致，均为半马齿型，其余品种均为马齿型。粒色除武科早303、武科早304为黄红色外，其余品种均与金穗3号（CK）一致，为黄色。轴色金穗607、甘玉804、兴达1602为浅粉色；武科早303、兴达1601、金穗606和金穗3号（CK）均为棕红色；武科早304为白色。

2.3 产量及构成因子

由表3可知，穗粒数金穗607最多，为630粒，较金穗3号（CK）多132粒；其次是甘玉804，为552粒，较金穗3号（CK）多54粒；其余品种均较金穗3号（CK）少。百粒重以金穗606最高，为31.6 g，較金穗3号（CK）高8.2 g；其次是武科早303，为28.4 g，较金穗3号（CK）高5.0 g；武科早304、兴达1601分别为27.7、24.5 g，较金穗3号（CK）分别高4.3、1.1 g；其余品种均低于金穗3号（CK）。折合产量以武科早304最高，为8 737.4 kg/hm2，较金穗3号（CK）增产1 186.9 kg/hm2，增产率为15.7%；其次是武科早303，为8 611.1 kg/hm2，较金穗3号（CK）增产1 060.6 kg/hm2，增产率14.0%；金穗607居第3位，折合产量8 585.9 kg/hm2，较金穗3号（CK）增产13.7%；金穗606为8 484.9 kg/hm2，较金穗3号（CK）增产12.4%。对产量进行新复极差比较，各品种间产量差异均达到极显著水平。

3 小结

在安定区海拔2 150 m的旱区，对引进的7个玉米品种进行了引种试验。结果表明，参试各玉米品种均可在9月中旬前成熟，武科早304、武科早303、金穗607、金穗606等4个品种综合性状优良。其中武科早304折合产量最高，为8 737.4 kg/hm2，较对照品种金穗3号增产1 186.9 kg/hm2，增产率为15.7%；武科早303折合产量8 611.1 kg/hm2，较对照品种金穗3号增产1 060.6 kg/hm2，增产率14.0%；金穗607折合产量8 585.9 kg/hm2，较对照品种金穗3号增产13.7%；金穗606较对照品种金穗3号增产12.4%。

张雷等人[5 ]认为全膜双垄沟播栽培玉米可在海拔2300 m以内的区域内种植。本试验通过对供试玉米品种的性状、生育期及产量结果进行综合分析，建议在安定区海拔2 100～2 300 m区域扩大武科早304、武科早303、金穗607及金穗606的种植面积，其他品种可在海拔2 100 m以下区域进一步试验。

参考文献：

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[4] 王承义，李继明. 不同地膜与覆膜期对全膜双垄沟播玉米的影响[J]. 甘肃农业科技，2016（7）：54-56.

[5] 张 雷，牛建彪，赵 凡，等. 旱作玉米提高降水利用率的覆膜模式研究[J]. 干旱地区农业研究，2006，

24（2）：8-11.

（本文责编：陈 伟）

MT-3是一种金属硫蛋白，又称神经生长抑制因子，其广泛存在于哺乳动物的各种组织中，但主要表达于脑组织，在神经胶质细胞和雄性生殖系统中也有表达[1 ]。MT-3的N端高度保守，而C端的氨基酸则相对变化较大[2 ]。据报道，表达MT-3的细胞保护DNA免受ROS破坏的能力更强，能更有效的保护单链DNA免受羟自由基的破坏[3 ]。在γ射线引起的氧化应激时，MT-3抑制了8-羟基鸟苷在细胞中的积累和基因突变，表现出抗癌和神经保护的作用[4 - 5 ]。在含有MT-3 的神经元中能够调节儿茶酚胺能 、谷氨酸能及γ-氨基丁酸（GABA）能的神经转换。研究表明，MT-3 可拮抗谷氨酸（Glu）对神经元的毒性，通过清除生成的 NO，从而起到神经保护作用[6 ]。目前，MT-3基因的序列在猪、绵羊、山羊、牦牛、猕猴、家鼠、鸡、牛、人等动物中均已公布，但其蛋白质结构和生物学功能还有待进一步研究。我们以从生物基因组数据库调取了牦牛MT-3基因的序列为基础，利用生物信息学相关软件和网页对牦牛 MT-3 基因及其编码产物的理化性质、亚细胞定位、蛋白质结构和生物学功能进行预测和分析，以期为深入研究MT-3基因及其编码蛋白的基本结构和生物学功能提供基础。

1 材料与方法

1.1 序列来源

数据资料来源于NCBI网站GenBank数据库MT-3基因的参考序列登录号[7 ]，包括牦牛（XM_014 479472.1）、人（NM_005954.3）、家鼠（NM_013603.2）、猪（NM_214056.1）、牛（NM_001113304.2）、绵羊（NM_001009755.1）、鸡（NM_001097538.1）、猕猴（XM_001266138.1）8个物种的mRNA序列。

1.2 方法

牦牛MT-3基因开放阅读框（Open reading frame，ORF）利用NCBI网页中的ORF Finder程序对其mRNA序列进行识别预测分析。MT-3 基因编码产物的理化性质采用 Bioedit 及 DNAStar 分析软件预测。亚细胞定位采用 PSORTⅡ预测[8 ]。功能域及功能分类采用 Prot Fun 预测[9 - 10 ]。跨膜区域的预测采用TMHMM 程序。二级结构采用 Jpred 分析预测。多序列比对及同源性分析采用 DNAMAN 软件分析。

2 结果与分析

2.1 牦牛MT-3基因的ORF分析

利用NCBI网页中的ORF Finder程序对牦牛MT-3基因的mRNA序列进行预测分析的结果见图1。从图1可以看出，牦牛MT-3基因序列中最大的开放阅读框长度为513 bp，起始密码子位于 55 bp 处，终止密码子位于 567 bp 处，分析有170 个氨基酸残基构成该编码产物。

2.2 牦牛MT-3基因编码产物序列同源性分析

利用DNAMAN软件对牦牛MT-3基因编码产物序列同源性进行分析的结果见图2。从圖2可以看出，MT-3在很多物种中均有表达，尤其与牛、绵羊MT-3氨基酸序列同源性较高，推测与牛、绵羊这2个物种在进化过程中的亲缘关系较近。从牦牛MT-3基因编码产物的系统发育树（图3）可以看出，牦牛、牛系统发育距离最近与牛的亲缘相似性高达99%。

2.3 牦牛MT-3基因编码产物的理化性质分析

氨基酸是蛋白质的基本组成单位，蛋白质的基本性质包括其相对分子质量、氨基酸组成和等电点等[11 - 12 ]。采用 Bioedit 及 DNAStar 分析软件预测牦牛MT-3基因编码产物的氨基酸组成的结果（图4）表明， MT-3基因编码 170个氨基酸，组成最多的氨基酸是 Cys（半胱氨酸），所占比例为 15.3%。其编码产物的理论分子量约为17 556.37 Da，理论等电点为 5.68。

2.4 牦牛MT-3基因编码产物的亚细胞定位分析

从牦牛MT-3基因编码产物的亚细胞定位结果（表1）可知，其分布在细胞核中的可能性为69.6%，分布在细胞质的可能性为13.0%，分布在线粒体的可能性为 4.3%，分布在细胞骨架的可能性为 12.9%。由此推断，牦牛MT-3编码产物主要在细胞核中发挥生物学作用。

2.5 牦牛MT-3基因编码产物结构功能预测与分析

牦牛MT-3基因编码产物结构功能分析采用ProtFun分析软件进行预测，其结构域是二级蛋白序列片段经过盘曲折叠形成的超二级结构，不同的结构域具有不同的特定的功能作用[12 ]。从表2可知，MT-3主要具有调控功能、转录和复制、翻译和辅酶因子的生物合成的功能，可能性分别为0.265%、0.194%、0.105%和0.051%。由此推断该蛋白具有调控功能的可能性最高，另外该蛋白在翻译、转录和复制中发挥着重要调节作用。

2.6 牦牛MT-3基因编码产物信号肽预测与分析

信号肽序列存在于分泌蛋白基因编码序列中，位于起始密码子之后的一段富含疏水氨基酸多肽的序列。如图5所示，预测牦牛MT-3基因编码产物不存在信号肽，无跨膜区，为非分泌性蛋白。

2.7 牦牛MT-3基因编码产物二级结构的预测与分析

对牦牛MT-3氨基酸序列进行二级结构预测采用在线预测工具 Jpred分析的结果（图 6 ）所知，牦牛MT-3 编码产物从 N 端的第 13个氨基酸才开始出现二级结构，前12个氨基酸均没有形成二级结构。MT-3蛋白二级结构主要由5个β折叠和多个无规则卷曲组成，没有α螺旋。

3 结论

研究结果表明，牦牛MT-3 基因 ORF 长度为 513 bp，编码170个氨基酸残基；组成最多的氨基酸是 Cys（半胱氨酸），所占比例为 15.3%，其理论分子量约为 17 556.37 Da， 理论等电点为5.68。MT-3在很多物种中都有表达，其中与绵羊、牛MT-3编码的氨基酸序列同源性一致，在系统发育树中的距离最近。MT-3 编码产物的二级结构主要以β折叠和无规则卷曲为主。MT -3 除具有神经生长抑制活性外，还可通过清除自由基和 NO ，从而起到神经保护作用。

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（本文责编：杨 杰）