参芪醒脑方对痴呆模型小鼠学习记忆能力及脑组织胆碱乙酰转移酶、乙酰胆碱酯酶含量的影响

贾晓玉　张兰　罗艺　孔李婷　袁一平　郭兆娟　翟华强　杨翠翠

摘要：目的 观察参芪醒脑方对氢溴酸东莨菪碱致痴呆模型小鼠学习记忆能力及脑组织胆碱乙酰转移酶（ChAT）、乙酰胆碱酯酶（AChE）含量的影响，探讨其防治老年痴呆的可能作用机制。方法 将ICR小鼠110只随机分为对照组、对照+参芪醒脑方高剂量组、模型组、多奈哌齐组和参芪醒脑方低、中、高剂量组。对照组和模型组小鼠给予蒸馏水灌胃，其余各组小鼠给予相应药物灌胃，每日1次，连续14 d。第15日Morris水迷宫实验、物体识别实验评价小鼠学习和记忆能力，行为学测试开始前20 min氢溴酸东莨菪碱腹腔注射诱发小鼠记忆障碍建立模型。Western blot检测小鼠皮层及海马组织ChAT、AChE蛋白表达。结果 Morris水迷宫实验结果显示，与对照组比较，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长（P<0.01）；与模型组比较，参芪醒脑方中、高剂量组小鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.05）。物体识别实验结果显示，与对照组比较，模型组小鼠对新事物探究能力明显下降、分辨指数明显降低（P<0.001）；与模型组比较，参芪醒脑方各剂量组小鼠分辨指数明显升高（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。Western blot结果显示，与对照组比较，模型组小鼠脑皮层及海马组织AChE蛋白表达明显升高（P<0.01）；与模型组比较，参芪醒脑方低、中剂量组小鼠脑皮层AChE蛋白表达明显降低（P<0.01），参芪醒脑方各剂量组小鼠脑海馬组织AChE蛋白表达明显降低（P<0.001），参芪醒脑方各剂量组小鼠脑皮层及海马组织ChAT蛋白表达均未见明显差异。结论 参芪醒脑方能明显改善氢溴酸东莨菪碱致痴呆模型小鼠的学习记忆能力，可能与降低脑内AChE蛋白表达有关。

关键词：参芪醒脑方；阿尔茨海默病；东莨菪碱；胆碱乙酰转移酶；乙酰胆碱酯酶；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.012

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）04-0056-06

Abstract： Objective To observe the effects of Shenqi Xingnao Prescription on learning and memory ability， contents of choline acetyltransferase （ChAT） and acetylcholine esterase （AChE） in brain tissue in mice models with scopolamine-induced Alzheimer disease （AD）； To investigate its mechanism for prevention and treatment for AD. Methods Totally 110 ICR mice were randomly divided into control group， control+Shenqi Xingnao Prescription high-dose group， model group， donepezil group， model+Shenqi Xingnao Prescription high-， medium-， and low-dose groups. The control and model group were given distilled water for gavage， and the other groups were given the corresponding medicine for gavage， once a day， for 14 days. On the 15th day， Morris water maze test and object recognition test were used to evaluate the learning and memory ability of each group. The model mice of memory impairment induced by intraperitoneal injection of scopolamine was established 20 minutes before the behavioral test. The expressions of ChAT and AChE in cortex and hippocampus were detected by Western blot. Results The results of Morris water maze test showed that compared with the control group， the model group had significant longer escape latency （P<0.05）； Compared with the model group， Shenqi Xingnao Prescription medium- and high-dose groups could shorten the escape latency （P<0.05）. The results of the object recognition test showed that compared with the control group， the ability of the model group to explore new things decreased and the discrimination index （DI） decreased （P<0.001）； Compared with the model group， Shenqi Xingnao Prescription groups could increase the DI of model mice （P<0.05， P<0.01， P<0.001）. The results of Western blot showed that the expression of AChE protein in the cortex and hippocampus of the model group was significantly higher than the control group （P<0.01）； Compared with the model group， Shenqi Xingnao Prescription low- and medium-dose groups could decrease the expression of AChE in the cortex in different degrees （P<0.01）； Shenqi Xingnao Prescription groups could decreaed the expression of AChE in the hippocampus （P<0.001）； There was no significant statistical significance in the expression of ChAT in the cortex and hippocampus in each group. Conclusion Shenqi Xingnao Prescription can significantly improve the learning and memory ability of AD model mice induced by scopolamine， which may be related to the descent expression of AChE protein in the cortex and hippocampus of the model mice.

Keywords： Shenqi Xingnao Prescription； Alzheimer disease； scopolamine； choline acetyltransferase； acetylcholine esterase； mice

阿尔茨海默病（Alzheime disease，AD）是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性疾病，主要体现为认知功能障碍和行为损害，对患者的生活、社交等造成极大的影响。乙酰胆碱（Ach）是一种重要的神经递质，由胆碱能神经元末梢释放，参与神经信号的传导，与学习、记忆密切相关[1]。乙酰胆碱酯酶（AChE）能够分解Ach，从而抑制信号的传递；而胆碱乙酰转移酶（ChAT）可将乙酰辅酶A转移到胆碱上，促进神经递质Ach的形成。当老年痴呆发生时，脑内胆碱能神经元数量减少，导致Ach合成、贮存和释放减少，从而导致学习记忆功能障碍[2]。研究表明，90%AD患者在神经冲动传输过程中缺乏胆碱[3-4]。因此，大脑内Ach系统对于学习记忆功能的形成和维持发挥着至关重要的作用，调节胆碱能系统功能的胆碱酯酶抑制剂成为AD药物研究的一个主要方向[5]。但目前临床治疗痴呆所选用的乙酰胆碱酯酶抑制剂，如他克林、多奈哌齐等，只能缓解症状，不能完全抑制或逆转AD的神经退行性病变发展进程，治疗效果并不理想，而且长期服用不良反应大。

AD属中医学“痴呆”“郁证”等范畴，王永炎院士认为“气虚-血瘀-痰瘀-酿毒-病络”为老年性痴呆早期的核心病机，其中气血亏虚是老年性痴呆早期发生的前提条件，痰浊瘀血是引起老年性痴呆的病理因素，毒损脑络和病络是早期痴呆发生的病机核心，使髓减脑消、神机失用，日久则发为呆病[6]。因此，针对以上病机，中医临床防治痴呆多以益气健脾、活血化瘀治其本，化痰清浊、解毒通络、醒脑开窍治其标，以使气血充足、脑髓充盈、神机复用。本实验所选用的参芪醒脑方由人参、黄芪、黄芩等组成，具有益气健脾、活血化瘀、安神益智、解毒通络之功效。临床上以参芪醒脑方的颗粒剂型给药治疗24周后，参芪醒脑颗粒组对中医证候评定分数有改善作用，而且在简易精神状态评价量表得分、老年痴呆量表-认知评分上优于多奈哌齐组[7]，但其作用机制并不十分清楚。本实验以东莨菪碱致小鼠痴呆为模型，观察参芪醒脑方对东莨菪碱致痴呆小鼠的行为学和脑组织ChAT、AchE蛋白表达的影响，探讨参芪醒脑方改善东莨菪碱致痴呆小鼠模型学习记忆能力的可能作用机制。

1 实验材料

1.1 动物及饲料

ICR小鼠110只，SPF级，4～5周龄，体质量（20±2）g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于室温（22±2）℃、相对湿度45%～60%环境，自由摄食饮水，分笼饲养。Co60灭菌饲料，北京科奥协力饲料有限公司。

1.2 药物

参芪醒脑方（人参、黄芪、黄芩等），采用醇水双提法提取，中国中医科学院中药研究所提供，药物浓度为2.24 g原药材/mL，4 ℃冰箱保存备用。盐酸多奈哌齐片，卫材（中国）药业有限公司，批号15020166。

1.3 主要試剂与仪器

氢溴酸东莨菪碱（Sigma公司）小鼠抗GAPDH一抗（北京中杉金桥），兔抗AChE一抗（Abcam， ab183591），兔抗ChAT一抗（Abcam， ab18736），山羊抗小鼠二抗（北京中杉金桥），山羊抗兔二抗（北京中杉金桥）。自制物体识别设备（首都医科大学宣武医院药物研究室），Multiskan Spectrum全波长酶标仪（Thermo Fisher公司），低温高速离心机（FRESCO 21，Sigma公司），纯水仪（PACIFICⅡ，Thermo Fisher公司），微量移液器（Thermo Fisher公司）。

2 实验方法

2.1 分组与给药

实验小鼠随机分为对照组16只、对照+参芪醒脑方高剂量组15只、模型组17只、多奈哌齐组14只和参芪醒脑方低、中、高剂量组（1.25、2.5、5 g/kg）各16只。屏障环境适应1周后开始给药，对照组与模型组予蒸馏水灌胃，其余各组给予相应药物灌胃。参芪醒脑方、多奈哌齐（1 mg/kg）给药相当于60 kg成人体质量10倍临床用量。给药体积为0.1 mL/10 g，每日1次，连续14 d。

2.2 造模

腹腔注射氢溴酸东莨菪碱1 mg/kg诱发小鼠记忆障碍建立模型，行为学开始前20 min注射造模。

2.3 Morris水迷宫实验

实验装置为一个直径80 cm，内表面黑色的圆形水池。将水池随机分为4个象限，逃逸平台放置在第2象限中央，位于水面下1 cm，实验时平台位置固定不变。实验期间持续给药，前2 d为训练阶段，不给予氢溴酸东莨菪碱造模，观察小鼠视觉及运动能力有无差别，对于有障碍的小鼠予以剔除。实验为期5 d，每日上、下午各进行1次，上午从第1象限入水，下午从第4象限入水。实验平行进行，第3日开始定位航行实验。行为学开始前20 min小鼠腹腔注射东莨菪碱，每隔2 min注射1只，以保证小鼠在进行行为学检测时体内血药浓度保持一致。小鼠面朝壁从象限中间位置入水，记录小鼠120 s内找到平台时间，记作逃避潜伏期。结束后，让其在平台上学习15 s。120 s未找到平台的小鼠，逃避潜伏期记为120 s。

2.4 新物体识别实验

第1日，将小鼠放在475 mm×350 mm×200 mm的空盒子里自由探索5 min。第2日，在盒子里放置2个相同的物体，记录小鼠5 min内对2个物体的探索时间（视小鼠鼻子靠近物体1 cm内为开始）。第3日，将其中1个物体换成新物体，记录小鼠在5 min内对新旧物体的探索时间。分辨指数=（新物体时间-旧物体时间）÷（新物体时间+旧物体时间）。

2.5 Western blot实验

2.5.1 脑组织匀浆制备

行为学测试结束后，冰上取材，分离出皮层、海马等组织。将动物组织（皮层或者海马）称重后按1∶7加裂解液裂解，超声匀浆21 s（7 s×3次），冰上裂解30 min，取出一部分裂解后的组织加5×上样缓冲液（Loading buffer）混匀（其余组织-80 ℃冻存），95 ℃加热5 min，12 000 r/min离心30 min，收取上清液，即得变性后蛋白样品。

2.5.2 胆碱乙酰转移酶、乙酰胆碱酯酶蛋白表达测定

将变性后的蛋白样品，采用改良RC-DC法进行蛋白定量。取30 μg蛋白样品进行凝胶电泳，经转膜，封闭2 h后，加入一抗兔多克隆抗体孵育1.5 h，4 ℃过夜，TBST漂洗5 min×3次，加入山羊抗兔二抗孵育2 h，TBST漂洗5 min×3次，用化学发光液发光，以GAPDH作为内参，以目标蛋白/GAPDH为蛋白的相对表达量。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析和t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 参芪醒脑方对东莨菪碱致痴呆小鼠模型逃避潜伏期的影响

与对照组比较，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，参芪醒脑方中、高剂量组小鼠逃避潜伏期明显缩短，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。

4.2 参芪醒脑方对模型小鼠分辨指数的影响

与对照组比较，模型组分辨指数明显降低，差异有统计学意义（P<0.001）；与模型组比较，参芪醒脑方各剂量组小鼠分辨指数显著提高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01，P<0.001），并有剂量依赖性趋势。结果见表2。

4.3 参芪醒脑方对模型小鼠脑皮层胆碱乙酰转移酶、乙酰胆碱酯酶蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组小鼠脑皮层AChE蛋白表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，参芪醒脑方低、中剂量组小鼠脑皮层AChE蛋白表达明显降低（P<0.05），参芪醒脑方高剂量组小鼠脑皮层AChE蛋白表达有降低趋势但差异无统计学意义，见图1。各组间小鼠脑皮层ChAT蛋白表达均未见明显差异，见图2。

4.4 参芪醒脑方对模型小鼠脑海马组织胆碱乙酰转移酶、乙酰胆碱酯酶蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组AChE蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，参芪醒脑方各剂量组小鼠脑海马组织AChE蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.001），见图3。各组间小鼠脑海马组织ChAT蛋白表达均未见明显差异，见图4。

5 讨论

Ach由胆碱、乙酰辅酶A在ChAT的催化下合成，存在于全身的神经组织中，而脑中Ach介导大脑神经元的传导，是多重神经系统学习和记忆过程的重要神经递质。人体缺少Ach则会加速脑细胞的衰老，使记忆力显著下降，甚至導致老年痴呆。

东莨菪碱是M受体阻断剂，可以拮抗Ach与M受体的结合，阻断大脑信息的传递，干扰短期记忆能力，从而引起记忆获得障碍[8-9]。Jackson J J等[10]研究表明，东莨菪碱可引起大鼠脑皮质AChE活性升高，从而导致学习记忆能力下降。另外，东莨菪碱制备痴呆模型具有简便易行、经济有效等优点，被广泛用于初步筛选促智药物和防治阿尔茨海默病的药物。本实验结果显示，给予1 mg/kg东莨菪碱可造成小鼠获得性记忆障碍模型，与报道一致[11-12]。

参芪醒脑方是在总结王永炎教授长期临床经验的基础上提炼的治疗AD的经验方，方中黄芪健脾益气、升阳举陷、托毒排脓，人参大补元气、安神益智、补脾益肺生津，黄芩清热燥湿、泻火解毒、凉血止血，全文共奏健脾益气、安神益智、活血化瘀、解毒通络之功效。其有效成分主要为人参皂苷、黄芪总苷、黄芩苷等。现代药理研究表明，人参皂苷 Rb1可促进Ach的释放，增加神经末梢对其的摄取，发挥改善记忆的作用，并抑制Aβ25-35诱导的神经毒性[13]；人参皂苷Rg1能够减少Aβ1-42蛋白的表达和tau蛋白的磷酸化，并能上调脑源性神经营养因子[14]。有研究者认为，黄芪总苷是一种天然的过氧化物酶体增殖剂激活受体γ激动剂，通过降低β-分泌酶的活性能最终下调Aβ的表达[15]。黄芩苷能够上调超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，从而提高机体的抗氧化能力[16]。

本实验对小鼠进行预防性给药14 d后，一次性腹腔注射东莨菪碱进行造模，造成学习记忆功能受损。实验发现，参芪醒脑方能够改善模型小鼠的学习记忆能力。有研究表明Ach在学习和记忆过程中起着关键作用，对学习的速度甚至学习的质量都有影响[17]。AChE则能够快速水解Ach生成乙酸和相应的胆碱，使其在胆碱能突触处终止神经传输。ChAT和AChE共同作用维持Ach含量的动态平衡，二者的活性反映Ach在脑中的合成和代谢速率[18-19]。参芪醒脑方能够降低脑组织内AChE含量，但对ChAT表达无明显影响，提示参芪醒脑方可能通过抑制AChE的表达，从而调节Ach的代谢来改善学习记忆能力。此外，参芪醒脑方具有中药复方多途径、多靶点的特性。加之，有效成分含量高、体积小、不含浸出溶媒、可久贮等优点，因此，其成药性强，可成为有效治疗AD的候选药。

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（收稿日期：2017-08-02）

（修回日期：2017-09-23；编辑：华强）