二色补血草总黄酮对功能性子宫出血模型大鼠子宫内膜VEGF、MMP-9表达的影响

欧莉，苗彦霞，吕娟，卫培峰

(陕西中医药大学，陕西　咸阳　712046)

无排卵型功能失调性子宫出血(Anovulatory Dysfunctional Uterine Bleeding,ADUB)又被称为无排卵型功血，是一种发病率较高的妇科内分泌疾病，临床表现为月经周期紊乱，经期时长时短，出血量过多或表现为不规则出血，属中医学“崩漏”的范畴[1-2]。二色补血草来源于白花丹科补血草属的多年生草本植物，全草入药;主要分布于辽宁、河北、甘肃、陕西、江苏、内蒙古等地。味甘、微苦，性微温,入脾、肝、膀胱经，有化瘀止血、益血通脉的功效，主治月经失调、崩漏下血、鼻衄、外伤出血等[3]。ADUB的发病机制目前尚不清楚，研究发现可能是由于神经内分泌功能失调，子宫内膜局部微环境出现改变，子宫内膜修复不能正常完成，导致子宫异常性出血[4]。子宫微环境中存在大量的生长因子、血管活性物质、蛋白酶及细胞外基质，均参与了功血的发生发展过程。本实验组前期的研究发现,二色补血草中主要成分总黄酮能通过雌激素样物质与孕激素样物质的共同协同作用治疗ADUB[5-6]，但其如何作用于子宫内膜局部微环境以及与血管新生的相关性目前尚不清楚。本文通过大鼠去势造模并利用雌激素负荷法建立ADUB子宫内膜增生症大鼠模型，并观察给予二色补血草总黄酮，大鼠子宫内膜血管内皮生长因子(VEGF)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达水平的变化，以期进一步解释其治疗ADUB的作用机制。

1　材料

1.1　仪器设备

恒温鼓风干燥箱(DHG-9075A型，上海一恒科技有限公司)；高速台式离心机(TGL-16G型，上海安亭科学仪器厂)；电泳仪(型号WS300，河北万生博朗电子有限公司)；全自动凝胶成像分析系统(型号ZF-288，上海嘉鹏科技有限公司)；彩色病理图像分析仪(型号M305487，西化仪——科技有限公司)；荧光定量PCR仪(型号7300，美国(北京)应用生物系统ABI公司)。

1.2　药物

参照文献[7]提取二色补血草总黄酮。料液比1∶10，浓度60%的乙醇为提取剂，回流提取3次，每次40 min。提取总黄酮后浓缩至38.8 mg/ml，4℃保存备用。宫血宁胶囊(0.13 g×18粒/盒，云南白药集团股份有限公司，批号20160724);苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸有限公司，1 mg/ml，批号1606171)。

1.3　试剂

兔抗大鼠VEGF、TIMP-1抗体、二氨基联苯胺(DAB)试剂盒和SABC试剂盒(武汉博士德生物制品有限公司)；RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；大鼠VEGF引物、大鼠TIMP-1引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)；Trans DNA Marker Ⅰ、PCR supermixⅠ、Ⅱ(北京全式金生物技术有限公司)。

1.4　动物

SPF级雌性SD大鼠，体质量180～220 g，购自西安交通大学实验动物中心，许可证号：SCXK(陕)2012-003。

2　方法

2.1　动物分组及造模

选取60只健康雌性SD大鼠，每组10只，随机分为6组：空白对照组、模型对照组、二色补血草总黄酮低、中、高剂量组和宫血宁组。除空白对照组外，其余大鼠手术取出双侧卵巢，术后第3天肌注苯甲酸雌二醇注射液(无菌花生油稀释至0.15 mg/ml)，隔日1次，连续给药14 d。空白对照组进行开关腹手术，术后第3天肌注相同体积无菌花生油[8]。

二色补血草总黄酮低、中、高剂量组分别灌胃给予二色补血草总黄酮97 mg/kg，194 mg/kg，388 mg/kg；宫血宁组灌胃给予宫血宁胶囊水溶液70 mg/kg；空白对照组和模型对照组灌胃给予相同体积的蒸馏水。去势造模后第7 d开始灌胃给药，1次/天，连续给药14 d。第14天给药后处死大鼠，将大鼠子宫表面的脂肪组织去掉后冰浴中分为两部分，液氮速冻后-70℃冰箱保存。

2.2　S-P免疫组化法检测各组大鼠子宫内膜VEGF、MMP-9的表达

将子宫内膜组织置10 %多聚甲醛中固定，石蜡包埋，5 μm切片；采用免疫组化S-P法对切片进行染色。切片常规脱蜡水化后，滴加稀释倍数为1:250的一抗，4℃孵育过夜，滴加生物素标记IgG工作液，37℃孵育30 min，滴加ABC复合物后37℃孵育20 min，滴加DAB显色液，37℃10 min，脱水后透明、封胶。采用彩色病理图像分析仪的图文分析系统对切片进行分析，随机选择3个视野/切片，双盲法观察，读取平均数。

2.3　RT-PCR法分析大鼠子宫内膜VEGF mRNA、MMP-9 mRNA的表达

将液氮冷冻的大鼠子宫内膜组织研成粉末，按试剂盒提取总RNA，用TransScript RT/RI Enzyme Mix合成第一链cDNA，DNA扩增，RT-PCR反应条件为：预防性94℃，5 min。变性94℃，1 min；退火55℃，1 min；延伸72℃，2 min；共35个循环，循环后延伸，72℃，7 min。实验时用β-actin作为内参。VEGF、MMP-9、β-actin引物见表1。

表1　RT-PCR 中所用引物序列

3　结果

3.1　各组大鼠子宫内膜VEGF、MMP-9蛋白表达的影响

与空白对照组比较，模型对照组的大鼠子宫内膜VEGF、MMP-9蛋白表达水平均出现显著性升高(P<0.01),提示子宫内膜异常增生，造模成功；与模型对照组比较，二色补血草总黄酮各组VEGF、MMP-9蛋白表达水平均有所降低，其中二色补血草总黄酮的高剂量组VEGF蛋白表达水平显著降低(P<0.01)，MMP-9的蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结果见表2。

表2　二色补血草总黄酮对大鼠子宫内膜VEGF、MMP-9表达的影响

注：与空白对照组比较，**P<0.01；与模型对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01

3.2　各组大鼠子宫内膜VEGF mRNA、MMP-9 mRNA表达的影响

与空白对照组比较，模型对照组大鼠子宫内膜VEGF mRNA表达水平明显升高(P<0.05),MMP-9 mRNA表达水平显著升高(P<0.01)；与模型对照组比较，二色补血草总黄酮中、高剂量组VEGF mRNA和MMP-9 mRNA表达水平均出现明显降低(P<0.05)。结果见表3。

表3　二色补血草总黄酮对大鼠子宫内膜VEGF mRNA、MMP-9 mRNA表达的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01

4　讨论

ADUB患者由于无孕激素拮抗的雌激素长期刺激，导致子宫内膜管腔变大、静脉毛细血管增加，提高了血管脆性，其发展过程与血管生成密切相关。VEGF主要作用于血管内皮细胞，是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，主要通过与血管内皮细胞表面的特异性受体结合，从而诱导血管生成。VEGF可促进微血管扩张，增加血管通透性，被认为是调控血管生成作用最强和特异性最高的调控因子[9-10]。病理情况下，VEGF可引起子宫内膜血管过度增生，增加血管渗透性并改变血管结构，导致子宫异常出血。基质金属蛋白酶(MMPs)是一组锌依赖内肽酶类，能降解绝大多数细胞的细胞外基质和胶原，主要表达在子宫内膜腺上皮、间质及血管基底膜上[11]。研究表明，子宫内膜组织缺乏孕酮时可促使MMP-9的合成与分泌，而正常生理浓度的孕酮几乎完全抑制MMP-9的合成与分泌。当孕酮撤退，子宫内膜上皮细胞和间质细胞在表皮生长因子和血管生长因子等细胞因子的作用下，通过旁分泌或自分泌形式产生大量MMP-9。MMP-9过度表达，既增加血管基膜的降解，又促进了炎性细胞的浸润，导致血管完整性被破坏，并出现炎症反应，最终影响子宫内膜的正常修复，导致子宫异常性出血。此外，VEGF与其受体KDR结合可增加MMP-9的表达水平，从而降解胶原纤维，增加血管脆性增加，进一步导致纤维蛋白水解，止血作用下降出现异常出血[12]。

本实验结果显示，造模后大鼠VEGF和MMP-9的蛋白和mRNA表达水平均出现显著性增加，导致子宫内膜异常增生。给予二色补血草总黄酮后，高剂量组可明显降低大鼠子宫内膜VEGF和MMP-9的蛋白和mRNA表达水平；中剂量组可明显降低大鼠子宫内膜VEGF、MMP-9的mRNA表达水平及VEGF的蛋白水平。说明二色补血草总黄酮治疗ADUB的机制可能是通过下调VEGF的转录和翻译水平，引起MMP-9的表达水平下降，减轻子宫内膜血管脆性从而达到止血的目的。