丁氏溃结灌肠液对溃疡性结肠炎模型大鼠黏膜组织炎症介质和PPAR-γ的影响研究

李睿瑛朱维娜赵 敏谭妍妍陆 琴丁 康张苏闽

（1.南京中医药大学研究生院，江苏南京210023； 2.南京中医药大学第三附属医院，江苏南京210001）

现代医学认为，溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）的发生发展与免疫、遗传、环境等多种因素相关，临床常用药主要为氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂、生物制剂以及微生态制剂等，部分药物副作用明显，且仍有一定复发率。中医药治疗UC有内服外用多种途径，疗效较好。丁氏溃结灌肠液是南京市中医院肛肠科丁泽民教授根据祖传经验方创制的，具有清热利湿、行气活血祛瘀、祛腐生肌等作用，临床应用以来，疗效确切，患者依从性好[1]。前期研究发现，其可能通过下调NF-κB信号通路的活性，减少炎症因子，同时增强机械屏障中的紧密连接蛋白（occludin）及免疫屏障中的免疫球蛋白A（IgA）的表达，抵抗葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的大鼠UC[2-3]。本研究将继续利用DSS诱导制备UC模型大鼠，通过检测药物对髓过氧化酶（MPO）、白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、诱生型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA、脂质过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR-γ）表达的影响，进一步探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物 清洁级SD大鼠，SPF级，8周龄，体重180～220g，雌雄各半，浙江省实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（浙）2014-0001。

1.2 药物 丁氏溃结灌肠液（药物组成：金银花、地榆、白及、复方珠黄散），由南京市中医院制剂室制备。取白及粗末煎煮2次，金银花、地榆煎煮2次，分别合并2次煎液，滤过，静置，取上清液浓缩。取珠黄散加入白及胶浆调成糊状后，加入金银花、地榆浓缩液，最后加蒸馏水至全量，100℃流通蒸气灭菌30min，即得。

1.3 试剂 葡聚糖硫酸钠（DSS）购自美国MP公司，批号：MP16011090；Real-time PCR试剂盒套装购于TaKaRa公司；ELISA试剂盒购于RayBiotech公司，批号：0513160728；美沙拉秦灌肠液由德国falk公司生产，批号：H20100253；贝索BASO大便隐血（OB）试剂盒由南京市中医院检验科提供；PPAR-γ抗体购于Cell Signaling Technology。

1.4 仪器 电动组织匀浆器，德国IKA T10；台式低温微量离心机，美国贝克曼Microfuge22R；全波长酶标仪，美国Bio-Tek Epoch；PCR反应仪，美国ABI7500。

2 实验方法

2.1 分组与造模、给药 随机选取8只大鼠作为空白组，其余大鼠使用DSS建立急性期溃疡性结肠炎模型。造模组大鼠予3.5%DSS溶液自由饮用，连饮7d，大鼠出现腹泻、便血、体重下降等症状视为造模成功，停饮DSS。空白组大鼠饮用纯水。将造模成功的大鼠随机分为模型组、美沙拉秦灌肠液组（简称美沙拉秦组）和溃结灌肠液低、中、高剂量组。各组饮水恢复正常，开始灌肠给药。按非标准体重动物的校正系数表[4]，人与大鼠换算系数为6.17，折算大鼠用药量。溃结灌肠液低、中、高剂量组分别予1.5g/kg、3g/kg、6g/kg药物灌肠，美沙拉秦组予美沙拉秦灌肠液2.4g/kg灌肠，灌肠量均为0.01mL/g，模型组给予等剂量生理盐水灌肠，空白组不予灌肠处理。灌肠3d后，复饮4%DSS连续5d，边饮DSS边灌肠，5d后停饮DSS，再继续灌肠治疗6d，总灌肠疗程为2周。

2.2 取材 治疗结束后各组大鼠予10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉取血，取距肛门上段2cm处结肠7～8cm，观察结肠黏膜大体形态并评分。用4%中性多聚甲醛溶液固定，送南京市中医院病理科，石蜡包埋，苏木精-伊红染色法（HE）染色，镜下观察并进行病理评分。

2.3 观察指标

2.3.1 一般情况 造模及治疗期间对大鼠进行一般情况观察，观察指标包括活动度、精神状态、毛发情况（稀疏、倒毛等）、饮食量，参照Cooper等[5]的研究进行评分，评分越高，炎症程度越重，计算疾病活动指数（DAI），DAI=（体重下降评分+大便性状评分+便血情况评分）/3。

2.3.2 结肠组织学观察 大体评分参考Ekström[6]标准进行评分：0分，无损伤；1分，黏膜充血，水肿，无糜烂或溃疡；2分，溃疡形成，溃疡面积≤受损面积25%；3分，溃疡面积为受损面积25%～50%；4分，溃疡面积≥受损面积50%。病理评分参照Dieleman等[7]标准。病变深度：0分，无病变；1分，病变侵及黏膜层；2分，病变侵及黏膜下层；3分，病变穿透黏膜。炎症程度：0分，无炎症；1分，轻；2分，中；3分，重。病变范围：0分，无病变；1分，≤25%；2分，＞25%，≤50%；3分，＞50%，≤75%；4分＞75%。隐窝损伤：0分，无；1分，1/3隐窝损伤；2分，2/3隐窝损伤；3分，隐窝损伤，上皮表面完整；4分，隐窝损伤，上皮表面消失。

2.3.3 髓过氧化酶（MPO）测定 参考文献[8]，取约150mg的末端结肠组织，悬浮在0.5%的溴化十六烷基三甲基（50mmol/L磷酸钾）pH6.0缓冲液中，制成10%匀浆液，匀浆10min，匀浆反复冻融3次，12000r/min、12min、4℃离心，取上清0.1mL加2.9mL O-Dianisidine（含0.0005%H2O2）。在460nm处测定3min，计算每分钟吸光度的变化（ΔA460/min）。25℃时每分钟分解1μmol过氧化物的量就定义为一个酶活性单位（U），根据公式计算MPO活力。MPO活 力（U/mg组 织）=[ΔA460/（1.13×10-2）]/0.7，取3min的平均值。

2.3.4 ELISA法检测大鼠结肠组织IL-6、TNF-α含量 按照说明书操作。

2.3.5 Real-Time PCR方法检测结肠组织iNOS mRNA表达水平 取少量冻存结肠组织，研碎，加1mL Trizol溶液，按说明书提取结肠组织RNA，测定纯度，取样品5μg，进行反转录合成cDNA，再取待测样品cDNA按说明书配制成总体 积 为20μL的RT-PCR反 应 体 系，PCR反 应 仪95℃、30s，95℃、15s，60℃、60s，进行循环40次，退火温度60℃。以β-actin作为内参基因，内参正向序列GGAAATCGTGCGTGATATTA，反向序列GGAGCAATGATCTTGATCTTC；目 的 基 因iNOS正向序列AAGAGACGCACAGGCAGAGG，反向序列AGCAGGCACACGCAATGATG。所有反应均设立3个复孔，相对定量，SYBR Green，选用2-△△Ct法。

2.3.6 免疫组化法观察结肠黏膜PPAR-γ 按照博士德免疫组化石蜡切片热修复抗原染色程序说明书操作，其中一抗稀释倍数（兔IgG∶PPAR-γ抗体为1∶500）。应用Image-ProPlus 6.0图像采集软件采集图像，在高倍镜（×100）下每张切片随机选取5个具代表性的视野，选择区域内的光密度平均值IOD/area（density mean），应用SPSS 13.0统计分析。

2.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件，结果用（±s）表示，进行正态性及方差齐性检验，符合条件者用单因素方差分析检验总体均数差异性，不符合者用非参数检验，用中位数和四分位数间距表示，使用Kruskal-Wallis H检验分析总体差异，再进行秩转换后，使用S-N-K检验进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠一般情况及DAI评分比较 空白组反应敏捷，活泼好动，毛色光泽，大便正常，饮水及进食量正常，体重逐渐增加。造模组在实验过程中逐渐出现懒动、活动量减少、扎堆、弓背等情况，进食和饮水量减少，体重增加不明显。各组DAI评分比较见表1。治疗后丁氏溃结灌肠液各剂量组间DAI评分比较差异无统计学意义（P＞0.05），丁氏溃结灌肠液中高剂量改善DAI评分的疗效与美沙拉秦相当。

3.2 各组大鼠治疗后结肠黏膜评分比较 模型组结肠黏膜可见不同程度的充血和水肿，肠壁黏膜可见散在的溃疡灶和糜烂出血点，伴有大量炎细胞浸润，大体评分与病理评分明显高于空白组（P＜0.05，P＜0.01）。丁氏溃结灌肠液各剂量组和美沙拉秦组大鼠结肠黏膜病变明显好转，大体评分与病理评分明显低于模型组（P＜0.05，P＜0.01）；丁氏溃结灌肠液各剂量组组间无明显差异（P＞0.05）；丁氏溃结灌肠液中高剂量对黏膜损伤修复效果与美沙拉秦相当。见表2。

3.3 各组大鼠治疗后MPO、IL-6、TNF-α、iNOS mRNA、PPAR-γ表达比较 结果见表3、表4、图1。MPO、IL-6、TNF-α含量在丁氏溃结灌肠液各剂量组组间无明显差异（P＞0.05），而丁氏溃结灌肠液高剂量组iNOS mRNA表达明显低于低剂量组（P＜0.01），PPAR-γ蛋白表达量明显高于低剂量组（P＜0.01）。在对MPO、IL-6含 量 以 及iNOS mRNA、PPAR-γ蛋白表达的改善方面，丁氏溃结灌肠液高剂量与美沙拉秦相当。

表1 各组大鼠不同时期DAI得分比较 分

表2 各组大鼠结肠黏膜大体评分与病理评分比较 分

表3 各组大鼠结肠黏膜组织MPO、IL-6、TNF-α含量比较（±s）

表3 各组大鼠结肠黏膜组织MPO、IL-6、TNF-α含量比较（±s）

注： 与空白组比较，#P＜0.05，##P＜0.01 ；与模型组比较，**P＜0.01 ；与美沙拉秦组比较，☆☆P＜0.01。

组别 动物数（只）剂量（g/kg） MPO（U/mg） IL-6（pg/mg） TNF-α（pg/mg）空白组 8 0.073±0.014 0.150±0.340 9.372±1.565模型组 8 0.217±0.027##0.453±0.063##19.661±2.219##美沙拉秦组 8 2.4 0.098±0.016**0.272±0.040**##11.131±1.742**丁氏溃结灌肠液低剂量组 8 1.5 0.134±0.057**#☆☆0.298±0.058**##15.647±2.385**##☆☆丁氏溃结灌肠液中剂量组 8 3 0.129±0.022**##☆☆0.280±0.040**##15.674±3.829**##☆☆丁氏溃结灌肠液高剂量组 8 6 0.110±0.040**##0.250±0.063**##14.755±1.708**##☆☆

表4 各组大鼠结肠黏膜组织iNOS基因、PPAR-γ蛋白表达量（±s）

表4 各组大鼠结肠黏膜组织iNOS基因、PPAR-γ蛋白表达量（±s）

注： 与空白组比较，#P＜0.05，##P＜0.01 ；与模型组比较，**P＜0.01 ；与丁氏溃结灌肠液低剂量组比较，△△P＜0.01；与美沙拉秦组比较，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

（g/kg）iNOS基因表达量PPAR-γ蛋白表达量（IOD/Area）空白组 8 1.463±0.104 0.288±0.023模型组 8 8.714±1.077##0.221±0.015##美沙拉秦组 8 2.4 5.897±0.551##**△△0.260±0.030#**丁氏溃结灌肠液低剂量组 8 1.5 8.106±0.198##☆☆0.232±0.017##☆丁氏溃结灌肠液中剂量组 8 3 7.279±0.326##**☆☆0.236±0.013##丁氏溃结灌肠液高剂量组 8 6 4.992±0.160##**△△0.268±0.013**△△组别 动物数（只）剂量

4 讨论

溃疡性结肠炎是反复发作的慢性炎症性疾病，属于炎症性肠病（IBD）。中医药治疗UC有明显优势。丁泽民教授创新性提出局部从“瘀”论治的辨证思想，创制丁氏溃结灌肠液，直接作用肠壁，充分发挥药物的局部作用[9]，处方以健脾化湿为主，配合清热化湿、调和气血，对于轻中度UC疗效确切[10]。

图1 各组大鼠结肠组织PPAR-γ表达情况（×100）

本研究利用3.5%DSS诱导溃疡性结肠炎模型，对大鼠进行DAI积分、大体评分、病理评分，发现模型组与空白组比较有统计学差异，说明造模成功。MPO的增高被认为是量化炎症的一项重要指标，本研究发现，模型组MPO含量明显高于空白组，丁氏溃结灌肠液和美沙拉秦灌肠液可以显著降低结肠炎大鼠MPO活性，高剂量与美沙拉秦效果相当，说明丁氏溃结灌肠液对DSS诱导的结肠炎具有一定的治疗作用。TNF-α及IL-6在UC肠道黏膜炎症的扩大中发挥了关键的作用。本研究结果显示，模型组结肠组织中TNF-α、IL-6均较空白组明显升高，而各药物治疗组上述指标明显低于模型组，提示丁氏溃结灌肠液、美沙拉秦灌肠液均具有下调局部炎性细胞因子过度表达，减轻炎症反应的作用，其中对IL-6的改善作用丁氏溃结灌肠液与美沙拉秦效果相当。iNOS是NO合成的限速酶，检测此酶可间接反映NO水平。生理剂量的NO对消化系统起重要的保护作用，但是NO产生过多或胃肠道平滑肌对其敏感性增强可导致溃疡性结肠炎。本研究发现，模型组结肠组织中iNOS的表达量显著增加，经丁氏溃结灌肠液中、高剂量干预后，iNOS表达量明显低于模型组，高剂量效果与美沙拉秦相当，证明iNOS可能参与溃疡性结肠炎的发展过程，进一步解释丁氏溃结灌肠液对溃疡性结肠炎的保护作用机制。

本实验选择美沙拉秦作为阳性药，它属于5-氨基水杨酸（5-ASA），通过调节各种细胞因子的产生而发挥抗炎作用。新近研究发现5-ASA可能通过氧化物酶体增殖物激活受体PPAR-γ途径发挥抗炎和抗瘤作用。PPAR-γ活化后可通过负性调节，调节不同的炎症信号转导途径，如NF-κB以及激活蛋白（AP-1）等[11]，从而减少促炎介质，如细胞因子、一氧化氮合酶的产生。前期实验证明，丁氏溃结灌肠液可下调Myd88、NF-κB p65蛋白表达水平，抑制NF-κB信号通路[2]。本研究结果表明，与空白组比较，模型组大鼠结肠黏膜中PPAR-γ蛋白表达量降低，而丁氏溃结灌肠液高剂量组和美沙拉秦组PPAR-γ蛋白表达明显高于模型组（中、高剂量与美沙拉秦效果相当），与结肠黏膜的损伤程度呈负相关。由此我们推测，丁氏溃结灌肠液可能起到PPAR-γ激动剂的作用。

本实验初步揭示丁氏溃结灌肠液可能通过上调PPAR-γ的水平，减少脂质氧化产物MPO的产生，抑制炎性介质TNF-α、IL-6和炎症蛋白诱导型一氧化氮合酶iNOS的表达，减轻结肠炎症反应，从而治疗溃疡性结肠，且其作用表现出一定的剂量依赖性。另外，我们在临床中发现，丁氏溃结灌肠液不仅仅用于疾病活动期，在缓解期也适用，可长期应用，因此，下一步我们将对丁氏溃结灌肠液的长期应用效果进行深入探讨。

（致谢：感谢为课题研究付出辛苦努力的课题组和南京市中医院中心实验室、病理科所有工作人员。）