台湾泥鳅奇异变形杆菌的分离与鉴定

孙翰昌 孙冲 刘迪

摘 要：该文从患烂鳃病台湾泥鳅分离了致病菌，进行生化鉴定及药敏试验。结果显示，台湾泥鳅烂鳃病的致病菌初步鉴定为奇异变形杆菌（Proteus mirabilis），而药敏试验结果表明，奥复星、环丙氟哌酸抑菌效果最好，其他依次为阿莫西林、氧氟沙星、头孢西丁、强力霉素、红霉素、氯霉素、VI、满、IV、卡那霉素、庆大霉素、四环素、复达新、复方新诺明、V、酮（先锋必）、多粘菌素、痢特灵，其余药物则没有抑菌效果。

关键词：台湾泥鳅；烂鳃病；奇异变形杆菌；抗生素

中图分类号 S941.42 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）07-0025-3

台湾泥鳅（Paramisgumus dabryanus ssp.）属鳅科花鳅亚科副泥鳅属，是大鳞副鳅的改良品种，具有个体大、生长速度快，肉质细嫩鲜美、营养丰富、饵料系数低等特点[1]。近年来，随着市场需求量的增加，集约化人工养殖泥鳅业迅猛发展。但高密度养殖及饲养管理不当容易导致疾病的发生，给泥鳅行业带来了巨大的经济损失。细菌性疾病是鳅科鱼类最常见的一种疾病，主要包括烂鳃病、肠炎病、赤皮病、出血病等[2]。其中细菌性烂鳃病是对淡水养殖鱼类，尤其是对集约化养殖鱼类危害最大。目前，已有鲤鱼（Cyprinus carpio）[3]、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）[4]烂鳃病原因及防治的相关研究，但国内未见有关台湾泥鳅烂鳃病的病因及防治研究的报道。为此，本研究对台湾泥鳅烂鳃病致病菌株进行了分离鉴定，并初步研究了27种抗菌药物对分离菌株的敏感性，以期为该病的诊断和防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 泥鳅 试验用鱼为重庆市永川区某水产养殖场内采集的100尾规格整齐、体质健壮、肌肉丰富、无病无伤、体色鲜亮、生活力强的台湾泥鳅。25℃暂养7d正常后用于试验。

1.1.2 实验药品及培养基 肠杆菌科细菌生化鉴定管及其他细菌生化鉴定所需试剂购自上海易佰聚经贸有限公司；常规药品均为实验室所有，LB培养基、显色配培养基均在实验室配置。

1.2 方法

1.2.1 致病菌提取、分離与鉴定 取典型烂鳃病濒死台湾泥鳅，体表用无菌水冲洗，75%酒精消毒，无菌取深层溃烂皮肤，在无菌匀浆玻璃器中研磨，并用无菌水按1∶1比例混合成悬液，涂布于固体培养基，于37℃恒温箱培养3d，然后进行划线分离。无菌挑取少量菌种，于LB培养基纯化。纯化后经革兰氏染色和相关生理生化鉴定[5]。

1.2.2 感染试验 分别用2mL、4mL、6mL的无菌水将奇异变形杆菌稀释成不同浓度梯度菌悬液，用1mL的注射器分别吸取0.2mL、0.4mL、0.8mL，进行肌肉注射，同法注射生理盐水作为对照组；25℃左右水族箱喂养，观察记录台湾泥鳅发病情况，解剖濒死台湾泥鳅并分离致病菌。

1.2.3 药物敏感试验 分离菌株接种平皿培养基，用无菌镊子取药敏片均匀贴在培养基表面，37℃培养24h，测定抑菌圈[6]。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定结果 分离菌株染色观察结果表明提取菌株为革兰氏阴性短杆菌，生化鉴定结果见表1、表2。本次试验结果为AG207，根据《肠杆菌科菌编码鉴定的数码组合表》[5]比对，初步鉴定AG207为奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）。

2.2 感染试验结果 肌肉注射菌悬液观察，第1d，注射0.2mL试验体死亡；3d后全部试验体死亡（见表3），且与自然发病台湾泥鳅症状相似，故再次确定奇异变形杆菌为致病菌。

2.3 药敏试验结果 根据药物敏感实验判定标准[7]判断：27种药敏片敏感试验中，奇异变形杆菌对奥复星、环丙氟哌酸、阿莫西林、达、氧氟沙星、头孢西丁、强力霉素、红霉素、氯霉素、VI、满、IV、卡那霉素、庆大霉素、四环素、复达新、复方新诺明、V极敏感；对酮（先锋必）、多粘菌素高度敏感；对痢特灵中度敏感；对苯唑西林、青霉素、万古霉素、氨苄西林、羧甲司坦、洁霉素c不敏感（见表4）。结果显示：奥复星、环丙氟哌酸、阿莫西林等18种极敏药物可作为治疗和预防台湾泥鳅烂鳃病的参考药物。

3 讨论

本研究鉴定的奇异变形杆菌可感染泥鳅发生烂鳃病，是导致台湾泥鳅烂鳃的重要病原。感染试验发现，奇异变形杆菌浓度与死亡速度成正比，推断试验体死亡可能与该菌的致死性毒素相关。

奇异变形杆菌引起动物染病死亡病例在水貂（Neovison vison）[8]、鸡（Gallus gallus domesticus）[9]、中华鳖（Trionyx Sinensis）[10]等有过报道。不同奇异变形杆菌菌株对药物敏感程度不同，朱明华等[11]试验得到奇异变形杆菌对青霉素、红霉素、四环素不敏感；陈武[12]试验得到奇异变形杆菌对庆大霉素、氯霉素、红霉素不敏感。本研究结果表明青霉素对奇异变形杆菌没有抑菌效果，与朱明华等研究一致。奇异变形杆菌敏感药物有差异可能与物种生活环境有关，也可能与不同物种养殖户用药导致的耐药机制有关。

泥鳅细菌性疾病发病原因复杂，感染速度快，容易给生产带来巨大的经济损失。养殖户常用化学药剂进行防治，由于泥鳅属于高密度养殖，容易造成水质恶化，泥鳅免疫力降低，因此，对泥鳅疾病的防治最好采用生物防治，以利于生态养殖。张涛等[2]认为在泥鳅饲料中适量添加中草药可以提高泥鳅的免疫力。

参考文献

[1]李艳华，胡佳，先大强，等.提高台湾泥鳅产后亲鳅成活率研究[J].黑龙江畜牧兽医，2017（8）：202-203.

[12]张涛，于家华，陆远东.泥鳅细菌性疾病生物防治技术[J].安徽农学通报，2015，21（14）：143，177.

[3]叶原土，李林贵，陈泽华.鲤烂鳃病的发生原因与杀菌药物研究[J].西南农林学报，1998，11（13）：111-119.

[4]丁庆秋，汪学平.草鱼烂鳃病的发病原因及防治方法[J].养殖与饲料，2012，9（47）：89-90.

[5]张庆华，瞿小英，郑岳夫，等.大黄鱼体表溃烂症病原菌的鉴定[J].上海水产大学学报，2003，12（3）：233-237.

[6]倪语星，王金良，徐英春，等.抗微生物药物敏感性试验规范[M].上海：上海科学技术出版社，2002：62-69.

[7]徐传和，朱洪权，郑林荣，等.奇异变形杆菌培养及其药敏结果分析[J].中国实验诊断学，2008，12（12）：1566-1567.

[8]胡传伟，贾赟，简中友，等.水貂奇异变形杆菌的分离与鉴定[J].经济动物学报，2006，10（2）：77-79.

[9]潘玉善，苑丽，刘建华，等.鸡大肠杆菌和奇异变形杆菌的分离、鉴定及药敏分析[J].江西农业学报，2009，21（12）：156-159.

[10]林亚歌，叶键，石婷婷，等.中华鳖源奇异变形杆菌的分离鉴定与致病性研究[J].水产科学，2014，33（12）：800-803.

[11]朱明华，朱瑞良，马荣德，等.鸡奇异变形杆菌的分离鉴定和16SrRNA基因序列测定与系统进化分析[J].中国兽医学报，2011，31（6）：804-808.

[12]陈武.鹿科动物奇异变形杆菌的诊治[J].中国兽医杂志，2002，38（5）：28.

（责编：张宏民）