生长分化因子15基因的克隆及重组原核表达载体的构建

董艳敏 刘满宇 张文慧 张林波

摘 要：为克隆人生长分化因子15基因，构建hGDF15基因的重组原核表达载体，为研究该基因的功能奠定实验基础，利用PCR技术克隆其基因序列，将其分别连接至pET28a和pColdI载体，构建重组pET28a-hGDF15和pColdI-hGDF15原核表达载体，并进行质粒PCR和双酶切验证以及测序验证。结果表明：重组载体构建成功，为进一步研究hGDF15蛋白的作用机制奠定基础。

关键词：人生长分化因子15；原核载体

中图分类号 Q78 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）11-0013-03

Abstract：For gene clone growth differentiation factor 15， constructing hGDF 15 gene recombinant prokaryotic expression vector， which laid the foundation for the study of the function of this gene， cloning the gene sequences using the PCR technology. Its connection to pET28a and pColdI carrier respectively， construct recombinant pET28a hGDF15 and pColdI hGDF15 prokaryotic expression vector， and verified plasmid PCR and double enzyme digestion and sequencing.The results show that the method of recombinant carrier is successful， which lays a foundation for further research on the mechanism of hGDF15 protein.

Key words：Human growth differentiation factor 15；Prokaryotic vector

糖尿病（Diabetes）是一类由遗传、环境、免疫等因素引起的严重威胁人类生命健康的慢性代谢障碍性疾病，其基本病理特征为胰岛素分泌绝对或相对不足，或外周组织对胰岛素敏感性的降低導致糖、脂肪、蛋白质、水及盐代谢紊乱的一种疾病[1-3]。近几年，全球糖尿病患病率逐年上升，预计到2030年，世界糖尿病患者人数将达到4.39亿[4-5]，但其病因和发病机制尚不完全明确。目前，糖尿病分为Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、内分泌性糖尿病、药物或化学诱导的糖尿病、伴有其他遗传综合症的糖尿病和妊娠期糖尿病等[6-7]。其中Ⅰ型糖尿病是因为β细胞被破坏，致使胰岛素的绝对不足。而Ⅱ型糖尿病是由于胰岛素分泌相对不足产生的胰岛素抵抗，这种类型糖尿病占患者总数的90%以上，主要表现为体型较肥胖，有口干、口渴等症状[8-10]。

人生长分化因子15（human growth differentiation factor -15，hGDF15）是TGF-β超家族的成员之一，于1997年由Bootcov[11]等首次从人的骨髓单核细胞系统U937 cDNA文库中被分离出来。目前，有大量证据表明hGDF15与肥胖及Ⅱ型糖尿病的发生与发展有着密切联系，如Kali[12]等研究比较GDF15的转基因小鼠与野生型小鼠，发现转基因小鼠能更好地预防饮食诱导产生的肥胖且有更高的胰岛素敏感性，同时发现转基因小鼠体内的棕色脂肪中脂肪分解标志物表达量增多。Macia[13]等对GDF15转基因小鼠进行腹腔注射葡萄糖耐量试验发现，转基因小鼠血糖下降明显，表明GDF15对葡萄糖耐受情况有所改善。Li[14]等用高糖诱导人脐静脉内皮细胞；推测出GDF15用负反馈的方式调节高糖诱导的活性氧簇表达，间接地改善胰岛素抵抗的情况。随着研究不断深入，hGDF15可能为肥胖和糖尿病的治疗带来新的方向，为患者带来福音。

本研究通过分子生物学手段，克隆hGDF15基因并构建重组原核表达载体，为下一步研究hGDF15在动物体内的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒和主要试剂 原核表达载体pET28a载体由本实验室保存、pColdⅠ购自宝生物工程（大连）有限公司。限制性内切酶NheⅠ、SacⅠ、Hind Ⅲ酶、T4 DNA ligase、10×T4 DNA ligase buffer、DL 2000 DNA Marker（TaKaRa）；质粒提取试剂盒（Gene Mark）；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（Axygen公司）、PCR产物纯化试剂盒（Sangon Bietech）。

1.2 方法

1.2.1 hGDF15基因引物设计 根据Genebank中公布的hGDF15基因序列，用Primer5.0进行引物设计，如表1。

1.2.2 hGDF15基因的PCR扩增 设计完成后送至上海生工生物工程有限公司合成。以携带hGDF-15成熟肽基因的原始质粒为模板，以P1/P2和P3/P4为引物扩增hGDF15基因，退火温度分别为56℃、68℃，扩增体系为P1/P2、P3/P4各1μL，模板1μL，ExTaq mix 12.5μL，ddH2O 9.5μL，PCR反应参数为：95℃预变性3min，95℃变性30s，56℃、68℃复性30s，72℃延伸1min，共计30个循环，最后72℃再延伸10min，4℃保温10min。反应结束后，制备1%琼脂糖凝胶，120V，电泳25min。

1.2.3 重组pET28a-hGDF15、pColdI-hGDF15载体构建及验证 使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，将回收纯化的PCR产物与pET28a载体分别用NheⅠ、Hind Ⅲ双酶切，PCR产物与pColdI载体分别用SacⅠ、Hind Ⅲ双酶切，产物用Sangon Bietech试剂盒进行纯化回收。纯化回收的基因与载体酶切产物连接，连接体系为T4 DNA ligase（350U/μL）1μL、10×T4 DNA Ligase buffer 1μL、pET28a 1.2μL、回收目的基因3.6μL、ddH2O 3.2μL，金属浴16℃连接过夜，16h。将重组质粒转化E.coli DH5α，转化后将菌液分别涂布于含有卡那抗性、氨苄抗性的LB固体培养基，37℃培养过夜，挑取阳性单克隆菌落分别置于含卡那抗生素、氨苄抗生素LB液体培养基内，振荡过夜。提取重组质粒，并进行重组质粒PCR及双酶切验证，验证成功后送至上海生工测序。

2 结果与分析

2.1 hGDF15基因的PCR扩增结果 经PCR扩增得到的hGDF15基因，其片段长度为339bp左右，目的基因产物条带清晰，条带与预期位置相一致（图1、2）。

2.2 重组pET28a-hGDF15和pColdI-hGDF15原核表达载体的鉴定 利用质粒提取试剂盒提取重组质粒，将2个重组质粒经PCR和双酶切验证，发现与目的基因大小相一致，且条带单一无杂带，重组原核表达载体验证成功后将其送至上海生工进行测序。对测序结果与Genbank中和hGDF15的序列进行比对，经DNAMAN Version5.2.2分析显示，二者氨基酸序列相似性为100%，说明重组pET28a-hGDF15和pColdI-hGDF15原核表达载体构建成功（图3、4、5、6、7、8）。

3 讨论

近年来，随着人们生活水平的提高，人们的饮食习惯发生着不合理的改变，各种代谢类疾病，如肥胖、高血脂症和糖尿病的患病数量逐年增加，呈上升趋势[15-17]。生长分化因子15（GDF15）是转化生长因子-β（TGF-β）超家族之一，其主要在巨噬细胞、脂肪细胞及内皮细胞中表达[18-19]。作为一种新型脂肪细胞因子，GDF15具有抗炎、促进氧化代謝、抑制食欲和减轻体重[20-21]的作用，能够改善肥胖和糖耐量[22]，有望成为治疗肥胖和Ⅱ型糖尿病的外周新靶点[23]。

pET28a载体为目前常用的原核表达载体，含有T7启动子以及多克隆位点，保证外源基因能够在大肠杆菌中复制。同时大肠杆菌表达系统因其易于操作、成本低廉、能够大规模快速生产等优点而被广泛应用。pColdI是Qing[24]等人利用冷休克基因cspA启动子开发了一系列独特性的冷休克表达载体，当温度突然下降时，原核生物和真核生物表现出冷激反应，通过合成冷休克蛋白来克服冷休克带来的不利影响。在低温下表达重组蛋白使大肠杆菌自身蛋白质合成受到抑制，促进目的蛋白正确折叠并增加蛋白质的可溶性。二者有利于实验后期hGDF15蛋白的大量表达及纯化。

为研究hGDF15蛋白在体内的作用方式，通过基因工程技术构建pET28a-hGDF15和pColdI-hGDF15重组原核表达载体，经过质粒PCR及质粒双酶切验证，载体构建成功，为进一步研究hGDF15蛋白在体内的作用机制奠定基础。

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（责编：王慧晴）