黑木耳中水溶性多糖提取条件的研究

李睿瑞 唐金敏 赵行建 娄旗辉 杨帆 韩如月 刘淑霞 荆瑞勇 王丽艳

摘 要：目的：优化黑木耳中多糖的提取工艺条件，明确黑木耳多糖的抑菌活性。方法：采用单因素试验和正交试验，研究提取时的液料比、提取时间和提取温度对黑木耳多糖提取率的影响。结果：提取温度是影响黑木耳多糖提取率的最关键因素，其次是提取时间，液料比对多糖提取率的影响最小。结论：黑木耳多糖最佳提取条件为液料比30，提取时间4h，提取温度95℃。在最佳提取条件下，黑木耳多糖提取率为5.16%。

关键词：黑木耳；多糖；提取条件；正交试验

中图分类号 S646.6 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）11-0009-03

黑木耳[Auricularia auricular（L.ex Hook.） Underwrd.]又称木耳，属担子菌纲（Basidiomycetes），木耳目Auriculariales，木耳科Auriculariaceae[1]。中国是黑木耳的主要生产国，产区主要分布在吉林、黑龙江、辽宁、内蒙古、广西、云南、贵州、四川、湖北、陕西等地，其中黑龙江省牡丹江地区海林市是中国最大的黑木耳基地，产出的黑木耳品质在全国名列前茅[2]。目前国内黑木耳有9个品种[3]，黑龙江地区有其中的8个品种。黑木耳多糖具有抗血栓[4]、抗凝血[5]、增强机体免疫功能[6]等多种有益于人体健康的功效，其含有丰富的甘露聚糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸等碳水化合物[7，8]，是菌中之佳品。本文利用正交试验法，对黑木耳多糖的提取条件的优化及粗多糖含量的测定进行了研究。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料和试剂 供试黑木耳，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院食用菌研究室选育。将黑木耳用粉碎机粉成粉末状态，过60目筛，保存备用。葡萄糖、正丁醇、氯仿、无水乙醇、浓硫酸、苯酚、活性炭等化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器 V-1000型可见分光光度计（翱世仪器（上海）有限公司）、TDZ5-WS低速大容量离心机（湘仪离心机仪器有限公司）、DK-8D三湿三控水槽（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、AR153CN电子天平（奥豪斯仪器（常州）有限公司）、DGG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）、SZC-101智能型自动提取索氏提取器（上海纤检仪器有限公司）等。

2 实验方法

2.1 标准曲线的绘制 精密称取105℃下烘干至恒重的葡萄糖10mg，用蒸馏水溶解定容至100mL。精密吸取葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于10mL具塞试管内，补充蒸馏水至2.0mL，摇匀，另取1支具塞试管加入2.0mL蒸馏水作为对照。各试管加入6%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0mL，混合均匀，室温放置25min，于490nm波长处测定吸光度。

2.2 黑木耳多糖的提取及纯化 将黑木耳粉装入滤纸包中，用SZC-101智能型自动提取索氏提取器除去脂肪，于40℃烘箱中烘干。称取黑木耳粉1.00g，以0.3mol/L的NaOH溶液作为溶剂，采用不同的液料比、不同温度、不同提取时间对黑木耳样品进行多糖的提取。完成浸提后于3000r/min离心10min，用5.0mol/L的盐酸调节上清液 pH至中性，滤液95℃下水浴浓缩至10mL，加入3倍体积的95%乙醇（30mL），静置过夜。3000r/min离心10min，收集沉淀，加50mL水复溶后，取出20mL向其中加入5 mL sevage试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1），振荡后静置分离，直到没有乳白色变性蛋白析出为止，收集分液漏斗中的上清液，向上清液中加入足量的活性炭，摇匀，恒温30min以上，过滤；取0.05mL过滤液加蒸馏水至2mL，于490nm下进行分光光度的测定。

2.3 多糖含量测定 黑木耳多糖含量测定采用苯酚-硫酸显色法[9]，具体操作同标准曲线。

2.4 单因素试验设计 精确称取样品1.00g置于100mL三角瓶中，考察液料比對多糖得率的影响，液料比分别为10、20、30、40、50，提取温度为85℃，提取时间为2h，提取1次，3次重复；考察提取时间对多糖得率的影响，提取时间分别为1h、2h、3h、4h、5h，液料比为30，提取温度为85℃，提取1次，3次重复；考察提取温度对多糖得率的影响，提取温度分别为55℃、65℃、75℃、85℃、95℃，液料比为30，提取时间为2h，提取1次，3次重复，按照2.2方法操作。

2.5 正交试验设计 拟采用正交试验设计优化黑木耳多糖提取条件，根据单因素的试验结果，选择液料比、提取时间、提取温度为影响因素，进行3因素3水平的正交试验设计，见表1。

3 结果与分析

3.1 标准曲线的制作 按照2.1进行实验操作，以葡萄糖量为横坐标，以A490为纵坐标，绘制标准曲线如图1所示。回归方程：y=0.0064x+0.0106，R2=0.9955。

3.2 单因素试验

3.2.1 液料比对黑木耳多糖提取率的影响 准确称量1.00g黑木耳干粉，液料比分别为10、20、30、40、50，提取温度为85℃，提取时间为2h，提取1次，3次重复。按照2.2的方法进行操作，结果见图2。由图2可知，黑木耳多糖提取率随着液料比的增加而呈现先增加而后稍有下降的趋势，液料比为30时多糖提取率达到最大值。从方差分析可知，当液料比为30时多糖提取率与液料比40和50无显著性差异，但显著高于液料比20和10。因此选取液料比20、30和40进行后续的正交试验。

3.2.2 提取时间对黑木耳多糖提取率的影响 准确称量1.00g黑木耳干粉，提取时间分别为1h、2h、3h、4h、5h，液料比为30，提取温度为85℃，提取1次，3次重复。按照2.2的方法进行操作，结果见图3。由图3可知，黑木耳多糖提取率随着提取时间的增加而呈现逐渐增加的趋势，提取时间为5h时达到最大值。从方差分析可知，提取时间为5h与4h时，多糖提取率之间无显著性差异，与1h、2h和3h之间差异显著。因此选取提取时间2h、3h和4h进行后续的正交试验。