库尔勒香梨×褐色句句梨F1代抗寒性研究

阿布来克·尼牙孜，李超海，章世奎，阿曼古丽·吾斯曼，唐章虎，董胜利

(新疆农业科学院轮台果树资源圃，新疆轮台 841600)

0 引 言

【研究意义】库尔勒香梨为新疆库尔勒地区的地方特色果树，果实皮薄肉细、汁多味甜、酥脆爽口耐贮力强。近年来，库尔勒香梨产业成为当地农民增收的支柱性产业。由于气候特性的影响，近年来当地-24℃以下的极端低温频繁出现，果园大面积出现冻害，严重制约了库尔勒香梨在当地的发展[1-3]。因此，分析比较不同群体库尔勒香梨一年生休眠枝在低温胁迫下的抗寒指标情况，明确其抗寒性，对选育抗寒性强的库尔勒香梨杂交后代有实际意义。【前人研究进展】近年来，针对库尔勒香梨易受冻害的缺陷，研究人员从化控和果园管理角度进行研究发现，生长期进行钙的叶面喷施和韧皮部注射、合理控制果园氮肥和磷钾肥的使用量、利用外源植物生长调节剂脱落酸和多效唑等均能够提高库尔勒香梨的抗寒性[4-7]。通过筛选抗寒性强的亲本与库尔勒香梨进行杂交选育出抗寒性强、果实品质好的库尔勒香梨杂交品种是一个行之有效的途径[8]。研究发现，新疆本地品种中褐色句句梨抗寒性极强、果实品质较佳[9,10]，适宜作为杂交亲本进行抗寒品种的选育。【本研究切入点】针对库尔勒香梨杂交实生苗的研究多集中在实生苗的童期特性及性状变异方面[11]，对于实生苗抗寒性的研究和早期鉴定则未见报道。研究库尔勒香梨和褐色句句梨两个亲本抗寒性及其对杂交后代的影响。【拟解决的关键问题】以3年生库尔勒香梨杂×褐色句句梨F1代群体和其亲本群体为研究对象，分析三个群体一年生休眠枝在人工低温胁迫下的抗寒指标，对比三个群体的抗寒性，观察抗寒性较强的褐色句句梨作为父本授粉后，能够有效提高杂交F1代群体的抗寒性。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验地为新疆农业科学院轮台果树资源圃(N41° 47'7 "、E84° 13'35 ")，海拔为976.1 m，位于天山南麓，塔里木盆地。天山南麓东端，塔里木盆地边缘，属于暖温带干旱大陆性气候，年平均气温10.6℃[12]。参试材料为30株库尔勒香梨×褐色句句梨F1代单株及杂交亲本个各3单株的一年生休眠枝。在2017年12月底取样，三个群体分别剪取有代表性、无病虫害、粗度较一致的一年生枝条，用凡士林涂抹在剪口处。每个群体剪取200个枝条，自然温度下保存，带回实验室进行低温胁迫处理和抗寒指标测定。

1.2 方 法

1.2.1 低温胁迫处理

用去离子水将采集的三个群体的枝条上的尘土冲洗干净，并用干纱布将枝条表面完全擦干。随后将每个群体的枝条随机平均分为10份(每份10根枝条)并用干纱布包裹，放入冷冻冰箱中进行低温胁迫处理。试验共设置了9个温度梯度，分别为-12、- 15、- 18、- 21、-24、-27、-30、-33和-36℃，以采集时试验地温度-12℃为对照。冰箱降温和升温速率均为4℃/h，下降到胁迫温度后维持10 h的胁迫时间，然后温度回升至到0℃，材料取出后，一部分立即用于测定枝条的相对电导率和恢复生长试验，另一部分保存于液氮中，用于其他生理指标的测定。

1.2.2 电解质渗出率测定和半致死温度的计算

将各处理的样品剪成0.05 mm左右厚的小圆片，每处理剪取3 g并充分混匀。称取三份各0.5 g的样品，按照周伟权等[13]的方法进行电解质渗出率的测定。用Logistic方程对温度和电解质渗出率进行拟合，并通过方程计算低温半致死温度。

电解质渗出率=(煮沸前的电导值/煮沸后的电导值)×100%。

1.2.3 可溶性糖、游离脯氨酸、丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性的测定

试验中可溶性糖采用蒽酮比色法测定，游离脯氨酸采用酸性茚三酮比色法测定，丙二醛采用硫代巴比妥酸比色法测定，超氧化物歧化酶活性采用氮蓝四唑比色法测定[14]。每个指标设三个生物学重复。

1.2.4 萌芽率

不同群组在低温胁迫后，各选取20个枝条，将枝条下端剪成斜口，上端用凡士林封口。将处理好的枝条扦插在以蛭石和河沙为基质的营养钵中，室温20℃培养，定期喷水保持湿度。培养一个月之后统计萌发的枝条数，计算萌芽率[13]。

萌芽率(%)=(萌芽数/调查芽眼数)×100%。

1.3 数据处理

试验中数据的标准误和单因素方差分析采用SPSS 19.0进行处理，图表用Excel2007进行绘制。

2 结果与分析

2.1 电解质渗出率差异

研究表明，随着胁迫温度的逐渐下降，三个群组一年生休眠枝的电解质渗出率快速升高，当温度低于-30℃时，电解质渗出率达到最大并不再变化。对比三个群组可知，母本库尔勒香梨一年生休眠枝在受到低温胁迫时细胞膜透性的变化最大，电解质渗出率显著高于其他两个群组。父本褐色句句梨和F1代杂交群体间的电解质渗出率在-24℃以前差异不显著，当温度继续下降时，F1代杂交群体的电解质渗出率开始快速增加，并显著高于父本褐色句句梨。由此可知，在遇到极端低温时，膜透性的变化由小到大依次为父本褐色句句梨>F1代杂交群体>母本库尔勒香梨。图1

2.2 低温半致死温度差异

研究表明，三个群体的电解质渗出率与胁迫温度之间有较强的线性相关性。相关曲线用Logistics方程拟合，方程拟合度均在0.900以上，达到极显著水平。对比三个群组可知，耐受的临界低温由低到高依次为父本褐色句句梨>F1代杂交群体>母本库尔勒香梨。表1

注：不同的小写字母代表差异在0.05水平达到极显著，下同

Note: the different lowercase letters in the figure represent the difference at 0.05 level, the same as below

图1 低温胁迫后各群组枝条电导率变化
Fig.1 The change of electrical conductivity of each group branches after low temperature stress

表1 低温胁迫后各群组枝条的低温半致死温度
Table 1 Semi-lethal temperature of each group branches after low temperature stress

群体GroupLogistic方程Logistic equation拟合度R2半死温度LT50 /℃库尔勒香梨 Korla Fragrant Peary=113.21/(1+6.551e-0.076x)0.937**-24.7库尔勒香梨×褐色句句梨 Korla Fragrant Pear ×Hesejujuliy=125.87/(1+6.241 e-0.069 x)0.969**-26.5褐色句句梨 Hesejujuliy=91.5/(1+5.709 e-0.061 x)0.951**-28.6

注：**表示拟合度在0.01水平，*表示拟合度在0.05水平

Note:**in the
Table indicates that the fitting degree is at 0.01 level,*indicates that the fitting degree is at the level of 0.05

2.3 萌芽率差异

研究表明，在经历低温胁迫之后，不同群组的一年生休眠枝的萌芽率随着温度的降低而同步下降。母本库尔勒香梨在温度低于-30℃后，芽体全部死亡。在各温度梯度的萌芽率差异较大。父本褐色句句梨和F1代杂交群体在温度低于-33℃后，芽体全部死亡。在超过半致死温度之后，各群组的萌芽率均明显降低。在-21～-27℃，三个群组在不同温度胁迫下萌芽率差异较大。三个群组在-21℃萌芽率差异不明显，父本褐色句句梨和F1代杂交群体的萌芽率在-12～-18℃差异不明显。表2

表2 低温胁迫后各群组枝条萌芽率变化
Table 2 The germination rate of each group branches after low temperature stress

胁迫温度Temperature stress(℃)萌芽率 Germination rate (%)库尔勒香梨Korla Fragrant Pear库尔勒香梨×褐色句句梨Korla Fragrant Pear ×Hesejujuli褐色句句梨Hesejujuli-1275.0076.5975.12-1562.50b69.14 70.00 -1855.56 56.6357.16 -2150.01 51.26 52.51 -2443.73 48.79 50.11 -2713.89 23.44 30.43 -300.00 11.16 25.17 -330.0010.03 14.12 -360.000.00 0.00

2.4 丙二醛含量差异

研究表明，随着胁迫温度的逐渐下降，三个群组一年生休眠枝的丙二醛含量逐渐升高。当温度低于-21℃时，枝条内丙二醛含量迅速增加。当温度低于-30℃时，枝条内丙二醛含量开始不再升高。对比三个群组可知，母本库尔勒香梨一年生休眠枝内丙二醛的含量显著最高，父本褐色句句梨一年生休眠枝丙二醛的含量最低，F1代群组一年生休眠枝丙二醛的含量与父本褐色句句梨更为接近。三个群组之间丙二醛含量差异显著。图2

2.5 可溶性糖含量差异

研究表明，随着胁迫温度的逐渐下降，三个群组一年生休眠枝的可溶性糖含量逐渐升高。当温度低于-21℃时，枝条内可溶性糖含量迅速增加。当温度低于-30℃时，枝条内可溶性糖含量开始逐渐下降。对比三个群组可知，当胁迫温度低于-21℃时，母本库尔勒香梨一年生休眠枝内可溶性糖的含量最低，父本褐色句句梨一年生休眠枝内可溶性糖的含量最高，三个群组之间可溶性糖含量差异显著。母本库尔勒香梨一年生休眠枝内可溶性糖的含量在-30℃时就开始下降。图3

2.6 游离脯氨酸含量差异

研究表明，随着胁迫温度的逐渐下降，三个群组一年生休眠枝的游离脯氨酸含量逐渐升高，当达到最大值后少量下降。当温度低于-21℃时，枝条内游离脯氨酸含量迅速增加。当温度低于-30℃时，枝条内游离脯氨酸含量开始逐渐下降。对比三个群组可知，当胁迫温度低于-21℃时，母本库尔勒香梨一年生休眠枝内游离脯氨酸的含量最低，父本褐色句句梨一年生休眠枝内游离脯氨酸的含量最高，三个群组之间可溶性糖含量差异显著。图4

图2 低温胁迫后各群组枝条丙二醛含量变化
Fig.2 Changes of MDA content of each group branches after low temperature stress

图3 低温胁迫后各群组枝条可溶性糖含量变化

Fig.3Changesinthesolublesugarcontentofeachgroupbranchesafterlowtemperaturestress

图4 低温胁迫后各群组枝条游离脯氨酸含量变化
Fig.4 Changes of free proline content of each group branches after low temperature stress

2.7 超氧化物歧化酶活性差异

研究表明，随着胁迫温度的逐渐下降，三个群组一年生休眠枝的超氧化物歧化酶活性逐渐升高，在半致死温度附近达到最大值，随后逐渐下降。当温度低于-15℃时，枝条内超氧化物歧化酶活性迅速增加。当温度低于-27℃左右时，枝条内超氧化物歧化酶活性开始快速下降。对比三个群组可知，当胁迫温度低于在-21～-30℃时三个群组之间超氧化物歧化酶活性的差异显著，且父本褐色句句梨一年生休眠枝的超氧化物歧化酶活性最高，母本库尔勒香梨一年生休眠枝的超氧化物歧化酶活性最低，F1代群组一年生休眠枝的超氧化物歧化酶活性与父本褐色句句梨更接近。图5

图5 低温胁迫后各群组枝条超氧化物歧化酶活性变化
Fig.5 Changes of superoxide dismutase activity of each group branches after low temperature stress

3 讨 论

植物组织在受到冻害之后，组织器官主要是因细胞膜结构受到破坏而失去正常的生理功能，从而导致组织器官整个死亡[15]。在植物抗寒性的研究过程中，研究人员发现受冻害后植物组织电解质的渗出率和枝条萌芽率能直观有效的衡量组织器官在低温胁迫之后的受害程度。同时，在受到低温胁迫时，组织中可溶性糖、游离脯氨酸能为组织的抗逆代谢提供能源和代谢底物，两个指标的含量是判定植物在判定植物组织的抗寒能力时的重要参考依据[16,17]。植物在受到低温胁迫时，由于正常的氧化还原代谢平衡被打破，代谢过程中产生的过氧和超氧根离子对细胞膜结构的稳定性和代谢平衡有较大的影响，组织超氧化物歧化酶活性与组织抗寒性高度相关[18]，超氧化物歧化酶含量的升高有利于清除代谢过程中的氧自由基，防止膜结构和细胞器因氧化而被损害。试验结果表明，父本褐色句句梨和库尔勒香梨×褐色句句梨的F1代群体电解质渗出率和丙二醛含量显著低于母本库尔勒香梨，可溶性糖含量、游离脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性显著高于母本库尔勒香梨，这个结果与计算的半致死温度及枝条萌芽率调查结果相一致。此结果与肖坤、何香、王一静和周伟权等[5,6,7,13]在库尔勒香梨抗寒试验中的结论一致。所以三个群组一年生休眠枝条的抗寒性由强到弱依次为父本褐色句句梨>库尔勒香梨×褐色句句梨的F1代群体大于母本库尔勒香梨。植物的抗寒性为数量遗传性状[19,20]，在植物的杂交育种过程中研究人员发现植物的多数数量性状有60%以上的概率表现出趋中遗传特性，有40%的概率表现出超亲现象[21,22]。研究结果也表明，库尔勒香梨×褐色句句梨的F1代群体的抗寒性介于父母本中间，且更偏向于父本的抗寒特性。

4 结 论

在各个胁迫温度处理下，三个群组相对电导率和丙二醛含量逐渐升高，可溶性含量、游离脯氨酸含量及SOD酶的含量均呈现“先上升后下降”的趋势。母本库尔勒香梨、F1代杂交群体及父本褐色句句梨三个群组一年生休眠枝半致死温度分别为-24.7、-26.5和-28.6℃。当胁迫温度达到-30℃时，库尔勒香梨电解质渗透率高达63.00%，显著高于其他两个群组。同时，库尔勒香梨丙二醛含量最高(20.39%)，褐色句句梨的最低(16.09%)。褐色句句梨可溶性糖含量最高(68.7%)，库尔勒香梨可溶性糖含量最低(60.3%)。褐色句句梨游离脯氨酸含量最高(36.82%)，库尔勒香梨游离脯氨酸含量最低(28.62%)。当胁迫温度低于-27℃时，三个群组SOD酶含量开始下降，褐色句句梨SOD酶活性最高(338 U/g)，库尔勒香梨SOD酶活性最低(297 U/g)。库尔勒香梨在温度低于-30℃后，芽体全部死亡；褐色句句梨和F1代杂交群体在温度低于-33℃后，芽体全部死亡。综上所述，三个群体中，父本褐色句句梨和F1代群体一年生休眠枝表现出较强的抗寒性，F1代群体的抗寒性稍弱于父本褐色句句梨，但显著高于母本库尔勒香梨。

参考文献(References)

[1] 李海燕，杨诗芳，巴哈古力·买买提.2000年以来库尔勒市果树冻害气象条件综合分析[J].沙漠与绿洲气象，2010,(4):55-58.

LI Hai-yan, YANG Shi-fang, Bahaguli Maimaiti. (2010). Synthetical Analysis on Weather Conditions of the Two Freezing Injury to Fruit Trees in Korla City since 2000 [J].Desert&OasisMeteorology, (4):55-58. (in Chinese)

[2] 刘志友，吴忠华.巴州库尔勒香梨冻害的发生原因及预防措施[J].新疆农垦科技，2011，(1):30-31.

LIU Zhi-you, WU Zhong-hua. (2011). Causes and preventive measures of freezing injury of Korla fragrant pear in Bazhou [J].XinjiangFarmlandReclamationScience&Technology, (1):30-31. (in Chinese)

[3] 巴特尔·巴克，克热木·伊力. 匡玉疆, 等. 库尔勒香梨历年冬季低温评价及严重冻害成因分析[J].新疆农业大学学报，2008，31(6):17-20.

Batur Bake, Karim Ali, KUANG Yu-jiang, et al. (2008) Evaluation of Low Temperature in Winter Over Years and Analysis on the Reasons of Korla Fragrant Pear Freezing Injury [J].JournalofXinjiangAgriculturalUniversity, 31(6):17-20. (in Chinese)

[4] Maienfisch, P., Huerlimann, H., Rindlisbacher, A., Gsell, L., Dettwiler, H., & Haettenschwiler, J., et al. (2001). The discovery of thiamethoxam: a second-generation neonicotinoid.PestManagementScience, 57(2):165-176.

[5] 肖坤.Ca2+对提高库尔勒香梨抗寒性的影响 [D].乌鲁木齐：新疆农业大学硕士论文，2014.

XIAO Kun. (2014).EffectofCa2+oncoldresistanceofKorlafragrantpear[D]. Master Dissertation. Xinjiang Agricultural University, Urumqi. (in Chinese)

[6] 何香，克热术·伊力，买合术提·卡热. 叶而施肥对提高库尔勒香梨抗寒相关性的研究[J].新疆农业科学，2012，49(8):1 401-1 407.

HE Xiang, Karim Ali, Mahemaiti Kare. (2012). Correlative Study of Foliage fertilization on Korla Fragrant pears for Improving Cold Resistance [J].XinjiangAgriculturalSciences, 49(8):1,401-1,407. (in Chinese)

[7] 王一静，克热术·伊力，肖坤. 外源脱落酸处理对库尔勒香梨抗寒性的影响[J]. 经济林研究, 2015, 33(3):13-19.

WANG Yi-jing, Karim Ali, XIAO Kun. (2015). Effects of exogenous abscisic acid (ABA) on cold resistance of Korla fragrant pear [J].NonwoodForestResearch, 33(3):13-19. (in Chinese)

[8] 魏立敏，秦岳，高宝宁. 抗寒优质梨杂交育种[J].特种经济动植物,2017,20(4):48-49.

WEI Li-min, QIN Yue, GAO Bao-ning. (2017). Cross breeding of cold resistant and high quality pear [J].SpecialEconomicAnimalandPlant, 20(4):48-49. (in Chinese)

[9] 阿依古丽·铁木儿, 玉苏甫·阿不力提甫, 帕提曼·阿布都热合曼,等. 新疆地方梨品种抗寒性评价[J].中国农学通报, 2014(28):217-225.

Ayiguli Tiemuer, Yusufu Abulitifu, Patiman Abudureheman, et al. (2014). Evaluation on Cold Resistance of Land Race Pears in Xinjiang [J].ChineseAgriculturalScienceBulletin, 30(28): 217-225. (in Chinese)

[10] 玉苏甫·阿不力提甫. 新疆的梨种质资源评价及核心种质库构建[D]. 乌鲁木齐：新疆农业大学硕士论文，2014.

Yusuf Ablitif. (2014).EvaluationonGermplasmResourcesandStructureofCoreGermplasmBankofSinkiangPear(PyrusL.) [D] Master Dissertation. Xinjiang Agricultural University, Urumqi. (in Chinese)

[11] 董胜利，李超海，张校立，等. 库尔勒香梨全同胞家系实生苗特性差异分析[J]. 北方园艺，2016,(5):13-16.

DONG Sheng-li, LI Chao-hai, ZHANG Xiao-li, et al. (2016). Analysis of Characteristic Differences of Seedlings from Full-sib Families of Korla Fragrant Pear [J].NorthernHorticulture, (5):13-16. (in Chinese)

[12] 王世伟. 干旱区绿洲灌溉条件下轮台白杏丰产栽培研究[D]. 乌鲁木齐：新疆农业大学硕士论文， 2013.

WANG Shi-wei. (2013).StudyonHigh-yieldCultivationforArmehiacavulgariscv.LuntaibaixingunderIrrigationConditionsinAridOasis[D]. Master Dissertation. Xinjiang Agricultural University, Urumqi. (in Chinese)

[13] 周伟权，杨文莉，杨花花，等. PP_(333)对库尔勒香梨抗寒性的影响研究[J]. 新疆农业科学, 2017, 54(7):1 259-1 268.

ZHOU Wei-quan，YANG Wen-li，YANG Hua-hua, et al. (2017). Effect of PP333 on Cold Resistance in Korla Fragrant Pear [J].XinjiangAgriculturalSciences, 54(7):1,259-1,268. (in Chinese)

[14] 邹奇.植物生理学实验指导[M].北京：中国农业出版社，2000: 129-174.

ZOU Qi. (2000).ExperimentalguidanceinPlantPhysiology[M]. Beijing: China Agriculture Press: 129-174. (in Chinese)

[15] Lyons, J. M. (1973). Chilling injury in plants. Annu.rev.plant Physiol,24(24): 445-466.

[16] 彭筱娜，易自力，蒋建雄. 植物抗寒性研究进展[J]. 生物技术通报，2007,(4):15-18.

PENG Xiao-na, YI Zi-li, JIANG Jian-xiong. (2007). Research Progress on cold resistance of plants [J].BiotechnologyBulletin, (4):15-18. (in Chinese)

[17] 程军勇，郑京津，窦坦祥，等. 植物抗寒生理特性综述[J]. 湖北林业科技，2017，46(5):16-20.

CHENG Jun-yong, ZHENG Jing-jin, DOU Tan-xiang, et al. (2017). Summary of Physiological Characteristics of Plant Cold Resistance[J].HubeiForestryScience&Technology, 46(5):16-20. (in Chinese)

[18] 和红云，田丽萍，薛琳.植物抗寒性生理生化研究进展[J]. 天津农业科学，2007，13(2):10-13.

HE Hong-yun, TIAN Li-ping, XUE Lin. (2007). Advances in physiological and biochemical research on cold resistance of plants [J].TianjinAgriculturalSciences, 13(2):10-13. (in Chinese)

[19] 宗成文. RAPD标记在桃属种质资源分类及抗寒桃育种中的应用研究[D]. 延边:延边大学硕士学位论文，2003.

ZONG Cheng-wen. (2003).StudyontheapplicationofRAPDmarkersintheclassificationofgermplasmresourcesofpeachgenusandbreedingforcoldresistantpeach[D]. Master Dissertation. Yanbian University, Yanbian. (in Chinese)

[20] 郭祥泉. 邓恩桉适应性栽植决策与抗寒-速生优株选择应用的研究[D]. 福州：福建农林大学硕士学位论文，2009.

GUO Xiang-quan. (2009). Studyontheselectionandapplicationofthecold-hardnessandrapid-growtheliteofEucalyptusdunniandthedecisionofappropriatecultivation[D]. Master Dissertation. Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou. (in Chinese)

[21] 李善文. 杨树杂交亲本与子代遗传变异及其分子基础研究[D]. 北京:北京林业大学博士论文，2005.

LI Shan-wen. (2005).GeneticvariationandmolecularbasisofthehybridparentandprogenyofPoplar[D]. PhD Dissertation. Beijing Forestry University, Beijing. (in Chinese)

[22] 吴翠云. 库尔勒香梨杂种后代性状遗传规律及生物学性状的研究[D]. 杨凌:西北农林科技大学硕士学位论文，2004.

WU Cui-yun. (2004).StudyontheCharactersInheritanceTrendandBiologicalCharactersofProgeniesofKuerlexiangliPear[D]. Master Dissertation. Northwest A&F University. Yangling. (in Chinese)