江西农业大学校园大型真菌大时间尺度物种变化研究

张俊波，宋海燕，吴均山，江 可，霍光华，胡颂平，胡殿明

（江西农业大学 江西省菌物资源保护与利用重点实验室，江西 南昌 330045）

大型真菌在自然生态系统中起着重要作用， 是生态系统的重要组成部分； 许多大型真菌种类具有食用、药用等重要经济价值，是重要的生物资源。了解大型真菌物种的时空变化规律是保护和利用该类资源的基础。然而，现有大型真菌资源调查研究主要针对大型真菌的空间分布[1-12]， 在时间变化规律方面的研究鲜有报道，偶有相关报道[2,4,13-15]也 是季节性变化研究，其研究的时间尺度一般不超过一年。研究大时间尺度(5 年以上)变化规律对了解大型真菌的生物学和生态学特点，及对其进行保护利用等都具有重要意义。本研究以江西农业大学校园为主要研究地点，在大时间尺度上长期跟踪研究，以探索其变化规律。

江西农业大学校园位于江西省中偏北部，赣江、抚河下游，鄱阳湖之滨，南昌市东北面，梅岭脚下，总占地面积 1.6万亩[16-17]， 地处东经 115°27′～116°35′、北纬 28°09′～29°11′。常年气候湿润温和、雨量充沛、日照充足，无霜期长、冰冻期短，属典型中亚热带湿润季风型气候[17-18]。 年平均气温在 17～17.7 ℃，年均降水量在 1 600～1 700 mm，年平均相对湿度为 78.5%[17]， 适合于各类植物和花卉的生长。校园内共有木本植物 88 科 274 属 412 种，裸子植物 8 科 22 属 29 种，被子植物 80 科 225 属 383 种，其中常绿树种有 200种，占总数 48.5%[16]； 落叶树种有 212 种，占总数 51.5%，两者比例接近 1：1[16]； 就株型而言，其中乔木198 种，占总数 48%；灌木 177种，总数 43%；藤本植物 37种，总数9%；三者比例约为 5：4：1[16]。 校园内植物多样性及优越的自然地理条件和生态环境孕育了丰富多样的大型真菌。

本课题组于2009 年开始对江西农业大学校园内大型真菌资源进行了初步调查，并于 2011 年完成第一次调查，采集标本 115份，鉴定为 76 种[1]。 为了长期跟踪调查江西农业大学校园大型真菌的物种多样性，探索同一地点的真菌物种在较长时间跨度的物种变化规律，本课题组一直对江西农大校园大型真菌进行调查，并补充记录了校园内大量以前未发现的物种。

1 材料与方法

1.1 研究材料

本团队于 2009 年 9 月—2011 年 11 月（第一次调查）及 2015 年 9 月—2017年 10 月（第二次调查），先后两次对江西农业大学校园本部为主各进行了为期2 年的大型真菌资源调查，采集的标本均保存于江西农业大学真菌标本馆 (The Herbarium of Fungi, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, China，HFJAU)。

1.2 调查方法

在学校本部采用踏查采集标本，且在大型真菌生长高峰期不定时频繁多次的调查采集大型真菌样品。对发现的所有大型真菌子实体进行现场摄影并采集，详细记录标本宏观形态及生境、习性及基质等相关信息，保持标本完整性带回实验室保存。

1.3 菌株分离与干标本制作

将采集的新鲜子实体带回实验室，采用组织分离和孢子弹射法进行菌株分离，并纯化保藏于江西农业大学菌种保藏中心(Culture Collection of Jiangxi Agricultural University, JAUCC)。取 剩余子实体一部分用硅胶干燥制作成干标本用于以后基因测序，剩余部分使用烘干器直接烘干，做成干制标本保藏。

1.3.1 组织分离法 使用酒精棉球将子实体外表的土壤及杂质清理干净，用灭菌后的刀片从菌盖中央将子实体切为两半，将菌盖与菌柄连接处的组织切为小块，用灭菌针头挑取组织小块接种至提前做好的 PDA培养基上，待长出菌丝后纯化。

1.3.2 孢子弹射法 先将滤纸中间打直径为 0.5 cm的小孔，121 ℃灭菌 30 min，冷却待用（滤纸需比培养皿大）。用酒精棉球将子实体外表的土壤及杂质清理干净，切取比滤纸孔稍大的菌盖，将无菌且打好孔的滤纸放在培养皿上，然后把切好的菌盖轻放于滤纸孔上，菌褶朝下，再将皿盖盖在滤纸上方。几小时后取出滤纸和菌盖，盖上皿盖，25℃培养，待孢子萌发后纯化。

1.3.3 硅胶标本 切取 2 cm组织块用卫生纸包住，置 入小号自封袋，向 其倒入变色硅胶盖住组织块后封口。若变色硅胶变色较明显，说明水分很多，需再加入变色硅胶，直至硅胶变色不明显，子实体完全干燥为止。

1.4 鉴定方法

广泛查阅大型真菌相关的彩色图谱及分类学专著[19-22]，采用宏观特征和显微结构观察等方法，对采集标本进行综合分析鉴定，正确界定科名、属名和种名，并对其经济应用价值和生态习性等进行归纳统计。

本研究以分离得到的纯菌株为材料，采用 CTAB 法提取总 DNA[11]。 提取过程直接采用 Mix 混合试剂，PCR 扩增引物为：ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和 ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）[23]。 PCR扩增条件为 95 ℃预变性 5 min，95 ℃变形 40 s，50 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1 min，35 个循环，72 ℃后延伸 10 min，1 0 g/L琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果；电 泳回收 PCR 产物，使 用了 2×TaqDNA PCRMasterMix（MT201）、琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒（DH101）回收 PCR 产物。PCR 产物送北京博迈德生物有限公司测序，使 用美国 ABI公司测序仪器(ABI 3030XL)，及 测序试剂盒 (ABI BigDye Terminator v3.1)进行测序[11]。所得序列在 NCBI上进行 Blast比对，进行初步的分子鉴定。

2 调查结果

2.1 江西农业大学校园大型真菌物种资源

本次调查为第二次调查，共采集大型真菌标本 160 余份（表 1）， 鉴定子囊菌门 2 目3 科 3属 5 种，担子菌门 9目 31科 54属 104种，合计 109 种，其中腐生菌 61种，共生菌6 种，寄生菌 1种，菌根菌41 种；食用菌 50 种，药用菌10 种，食药两用菌 8 种，毒菌10 种，分离纯化获得菌株 56 株。第一次调查鉴定担子菌门 7目 27科 42属 74 种。两次合计169 种。

2.2 大时间尺度物种变化

两次调查共采集大型真菌 42科，其中，第一次调查采集 27 科，第二次调查采集 34 科，两次调查都采集到的有18科，占总数的42.9%，即：Agaricaceae, Amanitaceae, Auriculariaceae, Clavariaceae, Entolomataceae,Fomitopsidaceae, Hygrophoraceae, Hymenochaetaceae, Lyophyllaceae, Marasmiaceae, Mycenaceae, Omphalotaceae,Physalacriaceae, Polyporaceae, Psathyrellaceae, Stereaceae, Strophariaceae, Tricholomataceae。

表1 两次调查的大型真菌科、属、种统计

两次调查共采集大型真菌 169 种，其中，第一次采集74 种，第二次采集109 种。两次调查都采集到的大型真菌有 13 种，占总数的 7.7%，即：紫褐蘑菇（A. rubellus） 、耳匙菌（A. vulgare） 、头状秃马勃（C.craniiformis） 、云芝（C. versicolor） 、粉迷孔菌（D. biennis） 、漏斗大孔菌（F. arcularius） 、硬柄小皮伞（M.oreades） 、长根奥德蘑（O. radicata） 、草地小脆柄菇（P. campestris） 、白黄小脆柄菇（P. candolleana） 、喜湿小脆柄菇（P. hydrophila） 、根白蚁伞（T. eurrhizus） 、东方栓菌（T. orientali） 。第一次调查采集到，而在第二次调查中未采集到的大型真菌有 60种，占总数的 35.5%。第二次调查采集到，而在第一次调查中没有采集到的有 96种，占总数的 56.8%。

表2 两次调查不同生长习性真菌数量统计 种

表3 两次调查不同经济价值真菌数量统计 种

表4 第二次调查大型真菌物种名录

续表4

续表4

续表4

续表4

3 小结与讨论

3.1 江西农业大学校园大型真菌资源

通过对江西农业大学校园大型真菌大时间尺度的调查，共鉴定大型真菌 42 科，81 属，169 种（表 4），其中伞菌科种类最多，达 25 种，占全部种类的 14.8%；多孔菌科 12 种，占总数的 7.1%；红菇科 11 种，占总数的 6.5%；3科真菌种数占总数的 28.4%。

按不同的生长习性划分（表2），腐生菌 101 种，占总数的 59.8%，外生菌根菌 60 种，占总数的 35.5%；共生菌 7 种，占总数的 4.1%；寄生菌 1 种，占总数的 0.6%。腐生菌物种数量过半，占绝对优势，这可能是因为校园内小林地面积较大倒木及枯枝落叶等多年积累，为腐生菌提供了适宜的生长环境。按经济价值划分（表 3），校园内大型真菌包括食用菌 77 种，占总数的 45.6%；药用菌 16种，占总数的 9.5%；食药用菌 8 种，占总数的 4.7%；有毒菌 25 种，占总数的 14.8%。

食用与药用菌共占 59.8%，其中有8 种为食药兼用菌，即：头状马勃（C. craniiformis）、 大秃马勃（C.gigantea）、 墨汁鬼伞（C. atramentarius）、 网纹马勃（L. perlatum）、 硬柄小皮伞（M. oreades）、 菌核侧耳（P.tuber-regium）、 大孢硬皮马勃（S. bovista）、 橙黄硬皮马勃（S. citrinum）， 其中菌核侧耳已经实现大规模的人工栽培，充分的发挥其菌核的药用价值且为农户带来了经济效益[24-26]； 柱状田头菇（A. cylindracea）、 盾形木耳（A. peltata）、 哥伦比亚侧耳（P. columbinus）、 巨大革耳（P. giganteus）等食用菌已经实现人工栽培，且深受人们喜爱；鸡枞菌（T. albuminosus）、 根白蚁伞（T. eurrhizus）、 裂纹白蚁伞（T. schimperi）、 条纹白蚁伞（T. striatus）、 灰褐纹白蚁伞（T. striatusf. griseus）、 黄褐纹白蚁伞（T. striatusf. ochraceus）、 端圆白蚁伞（T. tylerianus）， 这一类统称为鸡枞菌，是一种味道鲜美、营养价值极高的食用菌，尤其是在云南极其受消费者喜爱，由于这一类真菌和蚁共生，所以导致目前还未能实现人工栽培，致使野生鸡枞菌价格居高不下；药用菌有江西虫草（草木王）（C. jiangxiensis）、 大秃马勃（C. gigantea）、 云芝（C. versicolor）、 喜热灵芝（G. calidophilum）、 灵芝（G. lucidum）等，其中江西虫草为江西省特有虫草之一，是江西民间应用的一味珍稀名贵草药，主要用于治疗各种毒蛇咬伤[27-28]；云芝的多糖成分能提高人体免疫力，具保肝、抗癌等功效[29-30]。 我国食药用菌众多[31-32]， 但被人们认知利用的却很少，亟待更多的开发利用。

本研究分离到菌株 56株，其中包括食用菌柱状田头菇（A. cylindracea）、 盾形木耳（A. peltata）、 长根奥德蘑（O. radicata）、 哥 伦比亚侧耳（P. columbinus）、 弗 罗里达侧耳（P. floridanus）、 巨 大革耳（P. giganteus）、菌核侧耳（P. tuber-regium）、 鸡枞菌（T. albuminosus）、 黄褐纹白蚁伞（T. striatusf. ochraceus）、 端圆白蚁伞（T. tylerianus）等；药用菌大秃马勃（C. gigantea）、 江西虫草（C. jiangxiensis）、 云芝（C. versicolor）、喜热灵芝（G. calidophilum）、 灵芝（G. lucidum）、 橙黄硬皮马勃（S. citrinum）等。其中如柱状田头菇、盾形木耳、长根奥德蘑、巨大革耳等食用菌和喜热灵芝、灵芝等药用菌及菌核侧耳等是药用菌，现已经实现人工栽培，本研究所分离得到的这一部分菌株可作为遗传育种材料。鸡枞菌、黄褐纹白蚁伞、端圆白蚁伞等食用菌和大秃马勃、江西虫草等药用菌由于还未能够人工栽培，所以可作为驯化栽培的重要菌种资源及食药用价值进一步研究开发利用。

3.2 大时间尺度物种变化

本团队在2009年9月—2011年11月对梅岭高校区大型真菌资源的首次调查研究，共 采集标本115号，鉴定出 74 种大型真菌，占两次调查总物种数的 43.8%，另有 3 种鉴定到属，共采集 77 种[1]。 第二次调查采集到大型真菌 109种，占总物种数的 64.5%，其中 96 种在上次调查中没有采集到，占两次调查物种总数的 56.8%。由 此可见，对 一个地域短时间调查(调查1次或 1 年调查多次)所得结果难以反应该地域大型真菌真实的物种情况。另一方面，在上次调查所采集的 74种中，有 60种在本次调查中未采集到（表 4），占总物种数的 35.5%。这 60 种大型真菌有可能由于人为破坏、营养消耗殆尽、气候变化、植被变化等各种原因在江西农业大学校园消失了，或者在这次调查的 2 年期间没有产生子实体。两次调查所得大型真菌物种差异较大，只有 13 种是相同的，分别为：紫褐蘑菇（A. rubellus）、 耳匙菌（A. vulgare）、 头状秃马勃（C.craniiformis）、 云芝（C. versicolor）、 粉迷孔菌（D. biennis）、 漏斗大孔菌（F. arcularius）、 硬柄小皮伞（M.oreades）、 长根奥德蘑（O. radicata）、 草地小脆柄菇（P. campestris）、 白黄小脆柄菇（P. candolleana）、 喜湿小脆柄菇（P. hydrophila）、 根白蚁伞（T. eurrhizus）、 东方栓菌（T. orientalis）， 其中根白蚁伞为共生菌，头状秃马勃为菌根菌，其它均为腐生菌；这一类真菌能够长期生存于校园内，说明适合于它们生长的环境未受到破坏。这两次调查差异较大的主要原因可能为：两次调查相隔四年之久，近几年校园规划的改变、生境变化或受采集季节性、随机性及人为等因素影响，可能改变了部分物种的生长环境，致使两次采集鉴定结果重复性不高；部分真菌子实体的产生具有年周期性，几年为一结实周期，例如：大秃马勃、端圆白蚁伞、叶绿红菇等部分大型真菌，在同一位置时隔 3年二次采集到。

根据本研究的结果，用传统的踩踏采集大型真菌子实体的调查法，连续 2年多次调查所得大型真菌物种数占总物种数的 44.4%～63.7%。考虑到森林、山地等自然生境往往比校园面积大得多，且由于道路难行、时间有限等原因，难以做到全方位的覆盖的踩踏调查，因此，现有传统资源调查方法所得物种数可能占实际物种数的一半不到。再加上有些大型真菌具有特殊的结实周期性，实际物种数可能还更多。要摸清我国大型真菌资源家底，不仅要加强对新地域资源的调查，对于已经有调查数据的地区，也应该重复调查，并且可以采用现代分子技术辅助调查。

致谢：江西科技师范大学赵宽老师对牛肝菌属进行了鉴定，谨致谢意！

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