瞬时感受器电位香草酸受体3促进胶质瘤U251细胞系增殖和侵袭

李忠华，李慧峰，李晓蕾

（1. 贵州医科大学第三附属医院神经外科，贵州 都匀 558000；2. 大庆油田总医院病理科，黑龙江 大庆 163001；3. 贵州医科大学第三附属医院实验中心，贵州 都匀 558000）

神经胶质瘤是起源于神经外胚层的颅内常见肿瘤，占颅内肿瘤的50%以上，具有高发病率、高复发率、高病死率和低治愈率的特点。虽然临床上应用手术、化疗、放疗等综合治疗方法，但是中低分化星形细胞瘤和胶质母细胞瘤的治疗效果仍无明显改善，肿瘤多在术后7～10个月内复发[1]。因此，针对调控胶质瘤增殖、分化的表面分子以及信号通路等新治疗靶点的研究非常必要。瞬时感受器电位香草酸受体3 （transient receptor potential vanilloid 3，TRPV3） 是瞬时感受器电位通道蛋白的家族成员，被认为是一种钙离子通道蛋白，在皮肤、角化细胞、脑、脊髓、背根神经节等多种组织中都有表达，并通过接受细胞外信号发挥其生理功能，对机体产生影响[2-3]。在多种肿瘤中TRPV3都有表达，如结肠癌、肝癌、肺癌、膀胱癌等，并与肿瘤的发生发展密切相关[4]。但是，TRPV3通道蛋白在胶质瘤发展过程中的作用，仍未有相关研究和报道。本研究探讨了TRPV3通道蛋白对胶质瘤U251细胞系增殖和侵袭的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

U251细胞系购自中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库。培养基DMEM购自美国HyClone公司，胎牛血清购自四季青天杭生物科技有限公司。0.25%胰酶购自美国Gibco公司。MTT试剂盒购自美国Sigma公司。TRPV3抗体购自以色列Alomone公司。增殖细胞核抗原 （proliferating cell nuclear antigen，PCNA） 、基质金属蛋白酶2 （matrix metalloproteinase 2，MMP-2） 、基质金属蛋白酶9 （matrix metalloproteinase 9，MMP-9） 、细胞周期蛋白D1 （cyclin D1） 、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ （calcium/calmodulin-dependent kinase Ⅱ，CaMKⅡ） 、磷酸化-钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ （phospho-calcium/calmodulindependent kinaseⅡ，p-CaMKⅡ） 抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。RIPA蛋白裂解液、BCA试剂盒、蛋白质免疫印迹检测试剂盒均购自碧云天公司。ECL发光试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司。TRPV3 siRNA （20 nmol/L，正义：5’-ACCUG CCUGAUGAAAGCUUTT-3’，反义：5’-AAGCUUUCA UAGGCAGGUTT-3’） 购自上海吉玛制药技术有限公司，X-tremeGENE siRNA转染试剂购自美国Roche公司。

1.2 U251细胞培养与转染

37℃、5%CO2环境下，在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养细胞。分为空白对照组 （CON组） 、阴性对照组 （NC组） 、TRPV3 siRNA干扰组 （si-TRPV3组） 。细胞接种在6孔板中，培养至70%～80%融合后，按X-tremeGENE siRNA转染试剂说明书分别将TRPV3 siRNA和NC siRNA转染细胞，继续培养24 h后检测转染效率。

1.3 MTT法检测TRPV3对U251细胞系增殖的影响

各组细胞经0.25%胰酶消化后制成单细胞悬液，计数后以2000/孔接种到96孔板中，每孔总体积为100 μ L，每组细胞设置6个复孔，共接种于5块培养板中。在培养箱中继续培养24、48、72、96 h。按时间吸除培养液，每孔加入20 μ L无菌MTT溶液，继续在培养箱培养4 h，弃除孔内上清，每孔加入二甲基亚砜150 μ L，震荡15 min。应用酶联免疫检测仪，在490 nm波长处测定各孔光密度 （OD） 值。取6个复孔平均值，计算细胞的增殖率。

1.4 Western blotting

收集不同处理组的U251细胞，利用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA方法测定蛋白浓度，上样量为60 μ g，进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后封闭2 h。滴加一抗工作液，4℃冰箱过夜，滴加二抗，室温下孵育2 h，洗膜后进行ECL显色，应用自动电泳凝胶成像分析仪采集结果。

1.5 统计学分析

应用SPSS 16.0统计软件。数据以±s表示，采用t检验进行分析，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TRPV3 siRNA转染后U251细胞中TRPV3和PCNA蛋白表达减少

在U251细胞中敲除TRPV3表达，Western blotting检测发现，与CON组和NC组比较，siTRPV3组TRPV3蛋白表达明显降低 （P< 0.01） ，CON组和NC组比较无统计学差异；与CON组和NC组比较，siTRPV3组U251细胞中PCNA蛋白表达也减少 （P< 0.05） 。见图1。

图1 各组U251细胞中TRPV3和PCNA蛋白的表达Fig.1 TRPV3 and PCNA expression in U251 cells

2.2 敲除TRPV3表达后U251细胞增殖能力下降

MTT方法检测各组U251细胞的增殖能力，si-TRPV3组与CON组和NC组比较，不同时间点U251细胞增殖能力均下降 （24和48 h，P< 0.05；72和96 h，P< 0.01） ，CON组和NC组比较无统计学差异，见图2。

图2 MTT检测细胞增殖的变化Fig.2 Cell growth analyzed by MTT in U251 cells

2.3 敲除TRPV3表达后U251细胞侵袭能力下降

采用Western blotting检测不同处理后U251细胞中侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达，与CON组和NC组比较，siTRPV3组MMP-2 （P< 0.01） 和MMP-9 （P< 0.05） 蛋白的表达明显降低，CON组和NC组比较无统计学差异。见图3。

图3 各组U251细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达Fig.3 MMP-2 and MMP-9 expression in U251 cells

2.4 敲除TRPV3表达影响CaMKⅡ磷酸化和cyclin D1的表达

TRPV3是一种钙离子通透性蛋白，Western blotting检测结果显示，siTRPV3组U251细胞中p-CaMKⅡ表达明显少于CON组和NC组 （P< 0.01） ，见图4A；同时，cyclin D1的表达也明显减少 （P< 0.01） ，见图4B；CON组和NC组比较无统计学差异。

图4 各组U251细胞中p-CAMKⅡ和 cyclinD1蛋白的表达Fig.4 p-CAMKⅡand cyclin D1 expression in U251 cells

3 讨论

细胞内钙离子 （intracellular free Ca2+，[Ca2+]i） 是细胞内重要的第二信使，在多种生理、病理过程发挥作用，如调控细胞分化、增殖、凋亡、坏死等。研究[5]已证实胶质瘤的[Ca2+]i浓度高于正常细胞，对肿瘤细胞内信号转导的紊乱起了非常重要的作用。

TRPV3通道对Ca2+与Na+离子选择是10∶1，研究结果表明，TRPV3可作为一种钙离子通道蛋白。其通道开放使[Ca2+]i浓度升高，引起膜去极化，动作电位形成，细胞内信号转导机制被激活，进而调控神经传递、细胞周期进程、细胞凋亡等多种细胞生理功能[6-9]。研究[10]发现，TRPV3能够促进口腔上皮细胞的增殖和伤口愈合。因为其电导较小，可以传递长时程的钙信号，而长时程的Ca2+内流影响细胞增殖等一些慢细胞的活动。在膀胱癌的研究中发现，TRPV3基因激活后可明显减慢膀胱癌细胞增殖，促进凋亡[11-12]。在非小细胞肺癌研究中发现，敲除TRPV3表达，肿瘤细胞增殖能力下降[4]。本研究结果显示，在胶质瘤U251细胞中干扰TRPV3表达后PCNA表达减少，肿瘤细胞的增殖能力明显下降；同时侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达也减少，提示TRPV3能促进胶质瘤U251细胞的增殖和侵袭能力。

高浓度的Ca2+可通过激活磷脂酶C、蛋白激酶C、Ras/PI3K、ERK1/2等信号通路，通过多个环节参与细胞周期进程调控，影响肿瘤细胞的增殖和侵袭[13]。CaMKⅡ也受细胞内Ca2+浓度调节，可以绑定在Ca2+/CaM被激活而发生自动磷酸化，在结肠癌、卵巢癌等多种肿瘤中CaMKⅡ都被激活，促进肿瘤细胞的增殖[14]。本研究结果显示，U251细胞系中敲除TRPV3，p-CaMKⅡ表达减少，提示TRPV3影响了U251细胞内Ca2+浓度，进而影响CaMKⅡ的激活。

目前研究发现细胞内钙离子在多个环节参与细胞周期调控，可影响细胞周期相关蛋白的表达，如cyclin D1，启动细胞周期进程。cyclin D1在许多癌组织中过表达，且与癌细胞的增殖有关，可以通过调控细胞周期G1期限制点而调节细胞增殖[15]。本研究结果发现，U251细胞系中敲除TRPV3，cyclin D1蛋白表达减少，提示TRPV3蛋白通过影响细胞内Ca2+浓度，调控细胞周期蛋白cyclin D1的表达，进而影响细胞周期进程。

综上所述，TRPV3通道蛋白能够促进胶质瘤U251细胞的增殖和侵袭能力。其机制可能是TRPV3通道开放，细胞外Ca2+内流，cyclin D1过表达促进细胞的增殖。说明TRPV3通道蛋白与肿瘤的发生发展密切相关，为肿瘤靶向治疗提供了新途径，但是在不同肿瘤组织中TRPV3发挥的作用与机制还需要进一步探讨和研究。

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