大豆粕制备复合L-α-氨基酸螯合铜研究

解成骏，黄 超，徐怀春

（文山学院 化学与工程学院，云南 文山 663099）

在动物体内，特定的金属离子Mn+必须在小肠处与相应特定的L-α-AA螯合，形成特定L-α-AA-M，才能被小肠吸收，稳定进入细胞中，进入细胞后，特定L-α-AA-M在细胞中在酶的作用下裂解形成特定的L-α-AA与特定的金属离子Mn+才能分别被利用[1]。微量元素氨基酸金属螯合物L-α-AA-M独特的生化特性、吸收方式、代谢途径、安全性均优别于无机微量元素，具有较高的生物学效价，有益于动物的吸收利用。

特定的L-α-AA、特定的L-α-AA-M制品是合成动物、人体体液及各种脏器细胞的重要原料，由于具有特殊结构而具有特殊的营养、生理、生化等多种作用，且能全部被吸收，因此特定的L-α-AA、特定的L-α-AA-M制品高效、全能，广泛用于食品、医药、农药、饲料等行业，前景广泛[2-4]。

大豆、花生等中含有18种氨基酸，其中人体或动物体不能合成或合成速度及数量不能满足正常生长需要的8种必须氨基酸都有，豆类中含蛋白质20%～30%，与肉类中所含的蛋白质比例相近，大豆、花生等中构成蛋白质L-α-AA丰富且含量高。大豆粕含粗蛋白40%以上，以大豆粕为原料，制备L-α-氨基酸、L-α-氨基酸金属螯合物，可综合利用大豆粕等富含蛋白质的废弃物，变废为宝，具有广阔的应用前景[5]。

文山学院化学与工程学院申请的“用大豆饼或花生粕中制备L-α-氨基酸金属螯合物”项目（云南省教育厅2014年应用研究项目2014Y475）研究如何改变传统生产L-α-氨基酸、L-α-氨基酸金属螯合物的方法、表征、工艺控制困难、产率低的问题。

大豆粕或花生粕是榨取了油脂的副产物，已经除去了油脂等，其主要成分为粗蛋白，不同原料中蛋白质的含量、构成蛋白质的L-α-氨基酸组成、含量不同。具有特定立体体结构的L-α-氨基酸，与特定的金属离子螯合（也作为催化剂使用)[5-6]的能力各异，设计把大豆粕（蛋白质）原料特征水解，先把蛋白质立体空间结构中的纵向联接被解离而得直链蛋白质的同时加入金属离子，金属离子可把直链蛋白质分子中的L-α-氨基酸的基团结合拖出而与之螯合成L-α-氨基酸金属螯合物工艺简单，条件易控，产率高，可减少设备投入，降低能耗，缩短工艺时间。

本研究以大豆粕等为原料制备合L-α-氨基酸金属螯合物

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

大豆粕（云南昆明出产）；二水氯化铜（CuCl2·2H2O）（AR，广东汕头转宁化工厂）；氢氧化钠（AR，天津市凤船化学试剂科技有限公司）；硫酸（98 %）（AR，四川西陇化工有限公司）；无水乙醇（AR，天津市凤船化学试剂科技有限公司）；甲基红（AR，中国上海远航化工厂）；溴甲酚绿（AR，天津市化学试剂三厂）；EDTA（AR，天津市风船化学试剂科技有限公司）；过氧化氢（30 %，AR,天津市致远化学试剂有限公司）；溴化钾（AR，天津市风船化学试剂科技有限公司）；冰乙酸 （AR，上海申博化工有限公司）；甲醇（AR，天津市凤船化学试剂科技有限公司）。

天平（Precisa，XA220A，瑞士生产）；循环水式多用真空泵（SHB-III，郑州长城科工贸有限公司）；85-2数显恒温磁力搅拌器（金坛市大地自动化仪器厂）；傅里叶变换红外光谱仪（日本津岛)；DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医用光学器械厂）；201型回流装置。

1.2 方法

将大豆粕原料先除油脂和糖等，然后用酸控制特定的pH值，在特定的温度条件下水解若干时间后，再通过调控pH值结晶、除盐，制备复合的L-α-氨基酸金属螯合物，应用IR光谱法进行表征，再用配位滴定法测出其金属含量等进一步表征确定合成物为目标产物。

1.2.1 合成

1.2.1.1 复合L-α-氨基酸的制备

先安装电磁搅拌回流装置，然后用电子天平称取大豆糟粕50 g加入到圆底烧瓶中，用量筒量取3 mol/L硫酸200 mL加入到圆底烧瓶中，设置温度为100 ℃加热，水解8 h左右得到可溶性与不可溶性氨基酸和杂质，然后趁热通过抽滤泵抽滤除去不溶性杂质，在滤液中加入3 g活性炭，搅拌脱色10 min，通过抽滤泵抽滤除去活性炭和杂质，将滤液调节pH值为5～6蒸发结晶得粗复合氨基酸结晶，将晶体加入到烧瓶中加入冰乙酸回流45 min，通过抽滤泵抽滤除盐得滤液，然后向滤液中加入滤液体积8倍的丙酮使之析出得复合氨基酸结晶，最后用无水乙醇洗涤2～3次，将晶体干燥得纯复合氨基酸。

1.2.1.2 复合L-α-氨基酸铜螯合物的合成

将上面制得的复合氨基酸取6 g溶解在50 mL的水中，再向里面加入3 g氯化铜，滴加3 mol/L氢氧化钠溶液，调节到pH值为8，控制温度为45 ℃，恒温反应40 min，期间不断搅拌，然后将滤液冷却到室温，通过抽滤泵抽滤除去不溶性杂质，再向抽滤到的滤液中加入体积为8倍的甲醇，立刻会析出大量晶体，然后静置10 min，通过抽滤泵抽滤，得到复合氨基酸铜螯合物蓝紫色的晶体，用无水乙醇洗涤2～3次，真空干燥，得到纯复合氨基酸铜螯合物。

1.2.2 表征

1.2.2.1 IR表征

复合L-α-氨基酸有各自相应的特殊结构，同一复合L-α-氨基酸，结构相同，IR图谱相同，不同的L-α-氨基酸，结构有差异，IR图谱也变化，可以利用物质IR谱图的变化来表征合成产物。

复合L-α-氨基酸与L-α-氨基酸铜螯合物有各自相应的特殊结构，两者结构有差异，IR图谱也变化，因而可以利用物质的IR谱图的变化来表征合成产物。

复合L-α-氨基酸标准品、合成复合L-α-氨基酸、合成复合L-α-氨基酸螯合铜等IR图谱的制作：开启傅里叶红外变换光谱仪并使室内温度控制在18 ℃至20 ℃，相对湿度小于65%，制作复合L-α-氨基酸压片和溴化钾产品压片（标品和产品为1 mg，溴化钾为110至140 mg）。

KBr压片：取适量干燥后样品，在玛瑙研钵中与KBr研成均匀的粉末。将混合研好的粉末适量放在专用模具上，进行压片。

红外光谱测定：先进行背景扫描，再将压好的压片放到红外光谱仪上进行扫描，分别测定纯品复合L-α-氨基酸在400～4 000 cm-1的红外光谱。

1.2.2.2 配位滴定测定目标C螯合铜中的铜[7]

称取0.15 g左右产品（精确至0.1 mg）于250 mL锥形瓶中，加入1mol的硫酸溶液2.0 mL，待产品溶解后，加50 mL蒸馏水，再加入pH=5.4的六亚甲基四胺缓冲溶液20 mL和2～3滴二甲酚橙指示剂，用0.02161 mol/L的EDTA标准溶液滴定至溶液由紫红色突变为黄绿色，30 s内不褪色，即为滴定终点，记录所消耗的EDTA标准溶液的体积，测定3次。

产品中铜的质量分数按下式计算:

其中，W(Cu)为铜的质量分数，C(EDTA)为EDTA标准溶液的浓度（mol/L），V(EDTA)为滴定消耗EDTA标准溶液的体积（mL），63.55为铜的摩尔质量（g/mol），m为产品试样的质量（g）。

测定出金属含量，因为能够与金属螯合的氨基酸也是特征的，故可以推出复合L-α-氨基酸的含量，从而进行生产控制。

如果是单一的L-α-氨基酸金属螯合物可以测定金属含量，可以用薄层色谱法进行分离对比研究、或凯氏定氮法测定产品中的氮或测定产品中的碳的含量等，对产物进行确定表征。

2 结果与分析

2.1 制备复合L-α-氨基酸、复合L-α-氨基酸螯合铜

2.1.1 复合L-α-氨基酸

大豆粕50 g和3 mol/L硫酸200 mL加入到圆底烧瓶，设置温度为100 ℃，水解8 h左右，加入两勺活性炭脱色10 min，通过抽滤泵抽滤除质，调节pH值为5～6蒸发结晶得粗复合氨基酸结晶，然后将晶体用冰乙酸回流45 min，丙酮使之析出得灰白色晶体，进一步重结晶，得中间产物复合L-α-氨基酸，见图1。

图1 复合L-α-氨基酸产品

2.1.2 复合L-α-氨基酸铜螯合物

6 g的中间产物复合L-α-氨基酸和3 g氯化铜混合充分混合后，调节pH值=8，控制温度45 ℃，40 min，抽滤,滤液用8倍体积的甲醇结晶析出蓝紫色晶体，进一步重结晶，得目标复合L-α-氨基酸铜螯合物，见图2。

图2 复合L-α-氨基酸螯合铜产品

2.2 表征

2.2.1 IR表征

2.2.1.1 标准L-α-复合氨基酸（购）的IR图谱

用IR图谱制作法平行制作了自购标准复合L-α-氨基酸的IR图谱，重现性较好，取重现性最好的一个样进行分析，见图3。

图3 复合L-α-氨基酸IR图谱

2.2.1.2 自制复合L-α-复合氨基酸的IR图谱

用IR图谱制作法平行制做了产品复合L-α-氨基酸的IR图谱，重现性较好，取重现性最好的一个样进行分析，见图4。

图4 自制L-α-复合氨基酸IR图谱

标准品复合L-α-氨基酸IR图谱（●图）与产品复合L-α-氨基酸IR(▲图)比较

将上面重现性好的自购标准品复合L-α-氨基酸IR图与产品复合L-α-氨基酸IR图进行对比，初步确定自制产品为目标产物复合L-α-氨基酸,见图5。

图5 标准品(●)、合成产品(▲)的L-α-复合氨基酸的IR图的比较

从图5看出，●、▲两个IR图谱几乎一样，确定合成中间产物为目标产品为复合L-α-氨基酸。

2.2.1.3 产物复合L-α-氨基酸螯合铜IR图

用IR图谱制作法平行制做了产品复合L-α-氨基酸螯合铜的IR图谱，重现性也较好，取重现性最好的一个样进行分析，见图6。

图6 自制复合L-α-复合氨基酸螯合铜的IR图

复合L-α-氨基酸螯合铜(○)IR图与复合L-α-氨基酸(△)IR图比较

将上面重现性好的复合L-α-氨基酸螯合铜IR图与复合L-α-氨基酸IR图进行对比，初步确定合成目标产物不是同一个，用复合L-α-氨基酸在控制条件下可以螯合成复合L-α-氨基酸螯合铜，也可用其它方法进一步佐证表征（见图7）。

图7 复合L-α-复合氨基酸螯合铜（○）、复合L-α-复合氨基酸(△)的IR图

根据图7可知，复合L-α-氨基酸与铜离子螯合后，主要吸收峰同配体相比发生了明显位移，相对强度也有所改变。复合L-α-氨基酸在3 116.39-3 044.78 cm-1有较宽的吸收峰，表明复合L-α-氨基酸螯合铜中已无O-H键。复合氨基酸在3 367.55 cm-1处的N-H键有特征吸收峰，而复合L-α-氨基酸与铜离子螯合后，其N-H出现在3 261.38 cm-1处，说明螯合物中N-H键发生了明显的化学反应从而产生红移；复合L-α-氨基酸在2 947.09 cm-1处的C-H键有特征吸收峰，而复合L-α-氨基酸与铜离子螯合后，其C-H出现在2 955.59 cm-1处。由于复合L-α-氨基酸存在氢键，而发生缔合作用，使得复合L-α-氨基酸红外光谱没有出现N-H、C-H和O-H特征吸收峰比较弱而被掩盖。而形成螯合物后，没有氢键作用，螯合物中N-H、C-H和O-H特征吸收峰比较明显。由于形成环状化合物（？）有挤压作用使得键能增强，键力常数增大，像高波数移动，使得N-H、C-H和C=O发生蓝移。通过以上对红外光谱图的分析进一步说明复合L-α-氨基酸和铜离子已经螯合了。

2.2.2 复合L-α-氨基酸螯合铜金属含量测定

用配位滴定法测定复合L-α-氨基酸螯合铜中铜的含量，记录所消耗的EDTA标准溶液的体积，测定数据见表1 。

表1 复合L-α-氨基酸螯合铜铜含量的测定结果

由表1，得知铜含量的平均值为29.94%，用于生产控制，得到金属铜的含量就可以推知氨基酸的含量。

L-α-氨基酸中多肽链上的4个N-H键与铜离子螯合作用，所以具有非常稳定的结构，若测定样品中金属含量与其理论含量（a%=MCu/MCu（RCHNH2COO）2×100）比较表征研究。刘俊等在研究蛋氨酸铜螯合物合的制备与表征研究时就应用该法测定了蛋氨酸铜螯合物中铜的含量为17.08 %，理论值为17.53%，（误差在容量分析的规定范围内）从而进一步确定了其产物为成产物为目标产物L-α-蛋氨酸螯合铜，其分式为 Cu（CH3SCH2CH2CHNHCOO）2[8]。

3 讨论

用大豆粕为原料，通过特定温度下酸水解、纯化制备复合L-α-氨基酸，然后与氯化铜螯合制备复合L-α-氨基酸螯合铜，并通过对产品进行IR法表征研究。知晓了目标产物，在生产实际控制过程中，对L-α-氨基酸进行化学处理，通过简单的酸碱滴定，分析氨基羧基的数目就可以分析测量L-α-氨基酸；

通过测定L-α-氨基酸金属螯合物中金属的含量、也可以测知L-α-氨基酸金属螯合物的含量，实现生产控制；同时也可以对其它L-α-氨基酸金属螯合物的合成监测提供理论方法意义；还可以为生产优化工艺探究提供参考。

该复合氨基酸金属螯合物可广泛用于农药、化肥生产，不但提供缓释的金属离子作为杀菌剂、杀虫剂，更重要的提供了可用的各种氨基酸，解决了无机盐的弊端，可以达到增肥、农药的双重作用。崔秀明等曾经将该类化合物应用于三七根腐病的防治应用研究，探索了氨基酸金属螯合物对三七根腐病的防治效果,通过盆栽、种苗处理和大田试验等表明,氨基酸金属螯合物对三七根腐病有较好效果,综合防效达73.74%,接近进口农药58%瑞毒霉锰锌可湿性粉剂[9]。该产品也可以进一步纯化，通过控制恰当的量为医学、食品等行业提供补铜剂，安全性能优于无机补铜剂。

该法制备工艺容易操作、成本低，制得的产品纯度较高，其螯合物的结构稳定，制备的L-α-氨基酸与L-α-氨基酸螯合铜容易表征证明，为制备其它复合L-α-氨基酸金属螯合物提供可行方法，更可用于生产控制。

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