国内耳鸣动物模型方法比较研究

王丽 张璞 杨江东 杨菲菲 曲雁

河北医科大学第三医院（河北 050000）

耳鸣是在没有任何外界声音刺激下，患者耳内或者颅内产生的异常声音，可以是许多疾病的综合征，也可以是单独存在的疾病。严重的耳鸣会使患者产生焦虑、抑郁，而这些负面情绪又会加重患者对耳鸣的感受，从而形成恶性循环[1]。据不完全统计：全世界人口有17%患过耳鸣[2]，美国约25．3%，而这一数据仅占美国耳鸣人口的10%-15%，过于保守[3]。耳鸣的发病率较高，且还在增加，但其发病机制尚不明确，因此，动物模型的建立对耳鸣的研究至关重要。Jastreboff等于1988年建立了世界上第一个行为学的耳鸣动物模型[4]，国内学者在此基础上进行了大量的研究和改良，此类造模方法虽然得到了广泛的应用，但其存在一些问题值得我们进一步思考与研究。

1 耳鸣诱导方式的缺陷

耳鸣的病因繁多，但目前我国的耳鸣动物模型均由水杨酸类药物（水杨酸钠）所诱导。有学者指出，水杨酸对动物耳蜗毛细胞、螺旋节细胞、听神经及听觉皮层等均有影响，导致神经自发放电活动增加以及中枢重塑，该模型的建立有利于对耳鸣发病机制的研究[5]。但是，此诱导方式可能存在一定的不足。

1.1 水杨酸类药物并非引起耳鸣的主要病因

耳鸣的病因众多，郭焕萍等[6]对临床中以耳鸣为第一主诉就诊的2171例患者进行病因分类，得出位于前三位的病因分别为：不明原因591例（27．22%）、突发性聋549例（25．29%）及中耳疾病270例（12．44%），且前十位病因中并未出现水杨酸类药物。宋凡等[7]针对343例耳鸣患者进行研究，总结耳鸣的病因为：不明原因189例（55．1%）、突发性聋94例（27．4%）、梅尼埃病与噪声接触史各30例（8．75%），并无水杨酸类药物所致耳鸣患者。可见，水杨酸类药物并不是导致人类耳鸣的常见病因。原因可能是：1、水杨酸类药物的应用并不广泛。水杨酸类药物具有解热、镇痛及抗炎的作用，最早用于风湿疾病的治疗中，但随着医药事业发展，水杨酸在风湿疾病的应用早已被其他药品替代，如洛索洛芬钠片、美洛昔康片、双氯芬酸钠缓释片等，所以水杨酸类药物在临床中的应用已大大减少，由其导致的耳鸣患者则更是少见；2、水杨酸类药物是否导致耳鸣值得商榷，本人查阅文献并未发现国内有水杨酸类药物导致耳鸣的大数据病例报道及临床研究，绝大部分国内学者提出这一结论的依据均来自Mongan等[8]的发现，但水杨酸类药物是否可以导致国人发生耳鸣还需要进一步的证实。

1.2 水杨酸类药物诱导耳鸣动物模型的剂量不统一

诱导耳鸣的药物为水杨酸钠，腹腔注射的剂量为350㎎/kg．d[9-13]，以50-60kg换算到人类，剂量为17．5-21g/d。即使陈观印等[14]提出以低剂量水杨酸钠（120㎎/kg．d）诱导动物耳鸣，以上述人类体重换算后其应用量仍为6-7g/d。水杨酸在临床中的口服剂量远低于上述值，所以人类应用临床剂量的水杨酸是否出现耳鸣值得商榷。甚至有学者认为服用小剂量水杨酸对听觉系统有保护作用，可以拮抗其他耳毒性药物对听觉系统的损伤[15]。此外，国内文献对于水杨酸类药物诱导耳鸣动物模型的剂量值并无统一标准，许多研究并未提及水杨酸注射的时间，在试验方法描述较为详细的研究中，报道了水杨酸的应用时间为2-28天不等，可见耳鸣造模时间及水杨酸的应用总量在各项研究中并不一致（见表1）。

1.3 水杨酸诱导耳鸣多为短期耳鸣，与临床差别较大。大量研究表明水杨酸诱导耳鸣及听力损失多为暂时性的，停药后耳鸣逐渐消失，听力逐渐恢复。Yang等[16]用水杨酸诱导大鼠产生耳鸣，通过间歇-惊跳反射（Gap-prepulse inhibition，Gap-PPI），发现在水杨酸注射1小时后PPI下降，但注射2小时后，PPI值与注射水杨酸前水平一致，提示耳鸣已消失。Eggermont等[17]也指出，摄入大量的水杨酸会导致耳鸣及听力下降，但这些症状会在停药后逐渐消失。还有外国学者提到水杨酸在体内代谢周期为数小时至数天[18]。然而，我们在临床中面临的患者多为相对长期的耳鸣，并不会在短时间内逐渐恢复。综上，水杨酸诱导的耳鸣动物模型似乎并不能很好的反映人类的患病过程。

以上是国内外以水杨酸诱导动物耳鸣模型共同存在的问题，目前尚无完善的解决方法及统一的标准，仍需进一步探索。

2 耳鸣造模效果的验证方法的缺陷

2.1 目前耳鸣模型检验方法

表1 国内耳鸣动物模型总结Table 1 Summary about domestic animal models of tinnitus

由于耳鸣具有主观性，所以加大了耳鸣造模效果的验证难度，动物是否感受到耳鸣无法直观获得，目前多通过行为学方式进行检验。在巴甫洛夫经典条件反射的基础之上，Jastreboff等于1988第一次证明了水杨酸注射后的大鼠产生了耳鸣[4]。该模型应用“饮水抑制”法，在背景噪音中，烦渴的大鼠可自由舔水，背景噪音停止，再舔水被电击，使大鼠形成“声音存在时饮水，安静不饮水”的条件反射，其认为注射水杨酸后，实验动物在安静环境中出现饮水行为，即说明动物产生了耳鸣。国内许多学者模仿该行为学检验方法，如王洪田等[10]通过“饮水抑制”法复制了耳鸣模型，并在此基础上评价了某些药物治疗耳鸣的效果；贾明辉等[11]利用“饮水抑制”法原理，建议以“舔水时间”代替“舔水率”改良耳鸣动物模型；陈观印等[14]同样应用“饮水抑制”法原理，建立了低剂量水杨酸诱导耳鸣的动物模型；陈抗松等[13]通过动物“饮水抑制”法建立耳鸣模型，研究耳鸣动物听性脑干反应的改变，寻求耳鸣的客观表现。纵然国内许多学者在耳鸣造模方面做出相关研究，但查阅文献可知，其方法均如出一辙，无创新之处，且存在如下诸多问题。

2.2 国内耳鸣模型检验方法的不足

上述各研究造模成功的验证方式均为：实验动物在安静状态下饮水就说明产生了耳鸣，但是其中有些问题可能被忽视：1、进食、饮水、趋利避害是动物的本能，是多种非条件反射组合后的复杂行为，烦渴、饥饿或惊恐后出现饮水或进食，不能单纯认为是经过刻意训练形成的条件反射；2、动物有较强的模仿能力，周围同伴的安全饮水可能会影响实验动物的饮水行为，进而影响实验结果；3、水杨酸会使中枢神经系统的神经递质及受体发生改变，尤其是GABA、5-HT、谷氨酸、甘氨酸及其受体，从而影响神经递质正常的功能，会危害大鼠的智力和记忆力等[5]，使大鼠忘记被电击的经历，或者丧失了躲避危险的意识，表现为对电击的不畏惧，从而出现安静环境中的饮水行为；4、大剂量水杨酸会导致大鼠听力下降[19]，影响其对周围环境是否有声音的判断，也会对造模产生影响。5、动物有一定的学习能力，但这种能力在各个试验动物间有强弱差别，在国内的文献中，实验前均未对实验动物进行智力评估，只有少量文献注意到了造模淘汰率的问题[9,12]，其发现约有25%的试验动物无法完成条件反射的建立从而被淘汰，而大量研究报道的造模成功率均为100%（见表1），这在试验过程中显然很难完成，从而使一些并未很好建立条件反射的试验动物进入到了研究当中，势必对研究结果产生一定的影响。可见，利用“饮水抑制”法验证实验动物是否产生耳鸣仍需进一步改进。

2.3 以惊跳反射为基础的耳鸣模型检验方法

除条件反射外，国外目前应用更多的是利用惊跳反射进行耳鸣造模效果验证，这种方式在2006年被首次提出[20]，对比前者更客观、更科学。

惊跳反射检验耳鸣模型的原理为：突然出现的强烈刺激（强光、噪声等）会使动物出现一种防御性行为，表现为面部、颈部或骨骼肌的运动，这就叫惊跳反射。听觉惊跳反射（acoustic startle Response，ASR），即为突然的强声刺激使骨骼肌快速收缩。在惊跳刺激前适当的时间内给予一个合适的阈下刺激，可以抑制惊跳反射，即会使惊跳反射的反应幅度缩小，潜伏期缩短，这种现象叫做前脉冲抑制（prepulse inhibition，PPI）。当此阈下刺激为一个“无声间隔（slient gap）”时，出现的PPI即为“间歇惊跳反射”（Gap-PPI）。

余新[21]指出以75 dB SPL的白噪声为背景，115 dB SPL声音（特定软件系统发出，持续20ms）为惊跳刺激信号，在持续背景噪音中，给予动物一定时程无声间隔，而后继续给予背景噪音60-160ms，此时再给予惊跳反射刺激信号（20ms 115 dB SPL），ASR振幅较无Gap时减小，检测指标为前刺激抑制率PPI%=PP/P×100%，P为无Gap时ASR振幅，PP为被Gap抑制后的ASR振幅。当动物产生耳鸣时，耳鸣就会填充这个间隔，使惊跳反射的抑制程度减小。诱导耳鸣的动物对比无耳鸣的动物，惊跳反射的抑制程度缩小，从而说明耳鸣的存在，且抑制程度越小时的背景噪音与动物产生的耳鸣频率越相近。Yang等[16]通过水杨酸造模，当背景音为16kHz时，给予50ms间隔，惊跳反射的幅度抑制程度最小，说明水杨酸诱导动物产生的耳鸣频率可能集中在16kHz，而动物自身的耳鸣填充了间歇。Mulders等[22]利用噪声诱导耳鸣，通过Gap-PPI方式检验，研究噪声诱导耳鸣的豚鼠经颅电刺激（rTMS）对神经营养因子（BDNF）表达的影响，探索耳鸣的机制、寻求耳鸣的治疗方法；Krauss等[23]同样应用噪声诱导耳鸣产生，通过Gap-PPI方法验证，得出银杏叶提取物可减轻噪声诱导沙鼠的耳鸣。

惊跳反射属于动物本能的防御性反射，不需要人为建立，不违反动物正常习性，相对于利用条件反射进行验证则更为客观和可靠。但此种验证方法同样存在一些欠缺，受阈下刺激的性质、刺激给予的时机、阈下刺激与惊跳刺激间隔，以及动物的年龄、经验等心理及生理影响，仍有待于进一步完善[20]。所以，目前耳鸣动物模型的检验尚无绝对可靠及完善的方法，新的理论及验证方式需要提出与认证。

3 目前国内耳鸣模型尚不足以支持临床研究

合理的动物模型是进行后续研究的基础，目前国内的耳鸣动物模型均利用水杨酸钠诱导，利用“饮水抑制”法进行验证，并在此基础上研究某些治疗方式对于耳鸣的效果，如有学者通过水杨酸造模后利用电针刺激不同穴位，发现大鼠ABR阈值的改变，得出电针刺激可减轻和治疗耳鸣的结论[24]；还有些研究参考Jastreboff造模方法，利用补肾活血方及神经干细胞移植联合治疗耳鸣大鼠模型，并认为这种方法可以有效治疗耳鸣[25]。此类文章及结论有很多，就上述国内耳鸣造模存在的不足，这些研究及结论是否合理与科学还需要进一步的思考与研究。

4 问题与展望

综上所述，国内耳鸣动物模型的建立以水杨酸钠作为动物耳鸣的诱导剂，通过以“条件反射”为基础的行为学方法检验耳鸣的产生，促进了耳鸣的研究，至今仍发挥不可替代的作用。但此类模型发展到今天仍然存在一定的不足，造模方法较为单一，验证方式相对主观。目前需要更多的基础与临床研究，以期建立更好的耳鸣动物模型，从而服务于我们的科研和临床工作。

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