重组hfgl2-miRNA腺病毒在裸鼠人肝癌模型中的安全性初探*

王 鸣 刘君慧 习 东 宁 琴

华中科技大学同济医学院附属同济医院感染免疫研究所 (湖北 武汉， 430030)

肝细胞癌(HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，在肿瘤患者的致死率中高居第三位[1]。我国是HCC高发国家，发病率占世界范围的55%[2]。近年来肿瘤的基因治疗逐渐受到重视，探索并设计针对性的靶向干预药物，对新型肿瘤生物治疗的开发具有重要意义。我们研究发现fgl2凝血酶原酶(fgl2)在肝癌细胞中高表达，瘤内注射针对人fgl2的微小RNA(hfgl2-miRNA)可显著抑制肿瘤生长及肿瘤血管新生[3]。我们前期成功构建了腺病毒介导的重组人hfgl2-miRNA(Ad-hfgl2-miRNA)，体内外研究均证实对靶基因hfgl2具有显著抑制作用。目前，有关Ad-hfgl2-miRNA的生物分布及安全性问题尚很少涉及，因此，我们采用瘤内注射Ad-hfgl2-miRNA，观察其在裸鼠瘤内及非靶器官中的生物学分布，探讨Ad-hfgl2-miRNA的体内安全性，为Ad-hfgl2-miRNA的进一步临床研究做好铺垫。

1 材料和方法

1.1 实验动物 6～8周龄SPF级雄性BALB/c-nu裸鼠购自中国科学院上海实验动物中心，体重20～22g，饲养于本研究所IVC(智能型独立送回风净化笼具)，恒温恒湿条件下供应灭菌垫料、饲料、饮水。饲养1周左右开始实验。试验过程均需在无菌条件下执行。实验前将裸鼠随机分为实验组(Ad-hfgl2-miRNA)、阴性对照组(Ad-irrelevant-miRNA)，每组6只裸鼠，还有6只健康祼鼠作为空白对照组。

1.2 主要试剂 细胞培养基DMEM购自Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；SYBGREEN Mix购自日本TOYOBO公司；逆转录试剂盒购自Fermentas公司。

1.3 病毒、引物及细胞 腺病毒Ad-hfgl2-miRNA由本研究所前期构建和保存，使用TCID50法测定Ad-hfgl2-miRNA的滴度，按109IU/只的病毒量进行实验。PCR扩增所用引物由上海英骏生物技术有限公司合成；人高侵袭性肝癌细胞系HCCLM6购于复旦大学附属中山医院肝癌研究所。

1.4 裸鼠人肝癌皮下移植瘤模型建立 收集对数生长期的HCCLM6细胞，按1×106个/ml重悬细胞，选取祼鼠背部皮肤褶皱较多部位为注射点，按200μl/只接种细胞。术后每日观察祼鼠皮下移植瘤生长情况，测量并计算肿瘤体积(公式为1/2×最长直径×最短直径2)，待皮下移植瘤体积>100mm3时行后续实验。

1.5 给药与取样 按设定剂量，实验组每只裸鼠注射Ad-hfgl2-miRNA 1×109IU，阴性对照组每只注射Ad-irrelevant-miRNA 1×109IU，瘤内多点注射。于给药后第1、3、7、9、11、15、19、24天取裸鼠眼球血，并分别取出皮下移植瘤及心、肝、脾、肺、肾、小肠，液氮速冻，并保存于-80℃冰箱。空白对照组裸鼠仅末次取样。

1.6 实时荧光定量PCR 分别取50mg肿瘤及各脏器组织，加入1ml Trizol(4℃预冷)，按说明书方法提取总RNA，检测Ad-hfgl2-miRNA水平，引物序列为：上游引物5’-ACCAGCACAGTGTATCCG-3’，下游引物5’-CCAAGTTCTTCCACGCATT-3’，以GAPDH作为内参。反应条件如下：95°C预变性30s，95°C变性5s, 58°C退火5s，72°C延伸15s，40个循环。

1.7 生化指标检测 取第1、3、7、11、24天裸鼠眼球血，离心取血清后送同济医院检验科，分别检测谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶 (ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶L (LDH-L)等指标。

1.8 组织病理学检测 注射Ad-hfgl2-miRNA 1×109IU后第1、3、7、11、24天取裸鼠心、肝组织，置4%甲醛固定，石蜡包埋、切片，行HE染色，镜下观察病理学改变。

1.9 统计学方法 采用SPSS 13.0软件分析荧光定量PCR数据，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ad-hfgl2-miRNA在裸鼠人肝癌模型的体内分布及表达情况 见表1。hfgl2-miRNA在裸鼠心、肝、脾、肺、肾、瘤、小肠中均有表达，以心、肝、肾、荷瘤、小肠表达较强，可维持至给药后第24天。其中，第3天肝脏hfgl2-miRNA水平为表达高峰，较阴性对照组明显增高，具有统计学意义(P<0.05)。第3天与第7天的心、肾hfgl2-miRNA，表达较阴性对照组明显增高，两者比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，表达高峰出现在第7天。瘤组织、小肠hfgl2-miRNA水平，第7天为表达高峰，较阴性对照组明显增高，两者比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 3组小鼠生化指标检测结果 见表2。注射Ad-hfgl2-miRNA后，各时间点的ALT、AST、CK、LDH-L、BUN、Cr均未见明显异常或仅有轻度异常，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 两组裸鼠不同时间段Ad-hfgl2-miRNA在各脏器的表达量比较

与阴性对照组比较，*P<0.05

表2 3组祼鼠生化学指标检测结果比较

2.3 实验组裸鼠肝脏和心脏组织病理学变化 显微镜下可见肝脏和心脏组织轻微炎性细胞浸润，未见明显实质细胞损伤性改变(如：细胞大量坏死，明显出血等)，见插页图1。

3 讨论

作为一种新的凝血酶原酶分子，fgl2凝血酶原酶可直接促进凝血酶的生成而不依赖于其他凝血因子，凝血酶可通过降解纤维蛋白原形成纤维蛋白导致血栓形成和纤维素的沉积[4]。fgl2与肝癌的发生、发展密切相关。我们的前期研究发现：常见实体肿瘤如肝癌、食管癌、肺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的实质细胞、间质细胞、血管内皮细胞及细胞外基质均有fgl2凝血酶原酶的广泛表达，并与纤维蛋白沉积有密切组织学关系[5]。作为凝血酶的上游基因，我们推测fgl2在肿瘤生长、转移及血管新生中亦发挥了重要作用。我们应用裸鼠角膜血管新生模型和肿瘤皮下瘤移植模型显示fgl2基因沉寂后的人肝癌细胞诱导血管新生的能力显著降低；fgl2敲除的高侵袭性人肝癌细胞HCCLM6细胞增殖能力、侵袭能力，耐受TNFα诱导的凋亡能力、表达促血管生成因子如IL-8、VEGF的能力较未干扰HCCLM6细胞及非相关对照HCCLM6细胞均显著下降，表明fgl2在肿瘤细胞中的高表达在肿瘤的生长和转移中发挥了重要作用[6]。

基因治疗是将具有治疗价值的基因通过载体导入人体细胞中，直接进行表达，抑制、替代或补偿缺陷基因，以达到防治或减轻疾病的目的。腺病毒载体是基因治疗中最常用到的病毒载体，具有病毒滴度高、不整合到宿主基因组中、能够感染分裂相和非分裂相细胞等优点，这些优点使得腺病毒载体成为最适合用于癌症基因治疗的载体。我们运用Ad-hfgl2-miRNA观察其对裸鼠人肝癌皮下移植瘤的治疗效果，结果显示其可通过下调fgl2基因的表达而显著抑制皮下移植瘤生长，同时也观察到实验组裸鼠肿瘤组织内新生血管数目减少[7]。目前，部分基于腺病毒载体的肝癌治疗方案已进入临床I 期或II期研究[8]，有望在现有治疗水平的基础上，进一步提高肝癌患者的生存质量，延长生存时间，为今后肝癌等恶性肿瘤的治疗提供新思路。

作为临床前研究的重要部分，研究药物的生物分布及安全性对于观察药物是否能够扩散到非靶器官，从而寻找毒性靶器官具有重要参考价值[9]。近年来，基因治疗载体在体内的分布越来越受到重视。其中，对腺病毒载体的研究最为广泛和深入。目前，最常用的检测生物分布的方法是实时荧光定量PCR，其具有较高的灵敏性和特异性，不需要进行PCR 后续操作[10]。研究表明，给药方式的不同其生物分布亦有差别。Huang D[11]等通过不同给药途径注射靶向CD40 的腺病毒，结果发现：通过静脉给药后腺病毒主要分布在肺部和淋巴结，通过皮内注射后腺病毒主要分布在引流淋巴结和皮肤，而通过鼻内给药后腺病毒在肝脏和脾脏中均未检测到。胡卫[10]等通过瘤内注射重组腺病毒TOA02，发现腺病毒主要分布在瘤内、肝、肾、脾、肺、心脏，以瘤内最多。本研究同样使用瘤内注射的方式，结果显示腺病毒在心、肝、脾、肺、肾、瘤、小肠中均有表达，以心、肝、肾、荷瘤、小肠表达较强，与上述瘤内注射重组腺病毒TOA02的结果略有不同。腺病毒之所以分布于心、肝、肾、瘤等血供丰富的部位，可能是由于腺病毒主要与柯萨奇B病毒共用一种受体，即柯萨奇/腺病毒受体(CAR)[12]。CAR 分布广泛， mCAR 分布于心、肝、肾、肺等组织，且在肝脏中表达量最高。这种组织内的广泛分布通常是短暂的，待病毒含量下降后，各组织的病毒也会随之被清除。腺病毒载体的这一特点对某些仅需要外源基因短暂表达的基因治疗是有利的,基因的持续表达可能会引起机体功能紊乱和毒副作用的出现。

尽管基因治疗目前还处于起步阶段，在目的基因有效性及作用持久性、载体的靶向性和基因转移系统的可控性等方面存在一系列有待解决的问题，但可以预见，只要坚持严格的科学态度,设计精细的临床研究，基因治疗离人们将越来越近。

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