噬菌体P1侵染大肠杆菌Nissle 1917(EcN)机理研究

于晏璎，周贤轩

(合肥工业大学食品科学与工程学院，安徽合肥 230009)

噬菌体P1是一种溶源噬菌体，可以侵染大肠杆菌和一些其他的革兰氏阴性菌。噬菌体P1之所以引起研究者兴趣，是因为它可以捕捉宿主的基因组DNA包装在蛋白质衣壳里面作为自己的基因，从而产生新一代的噬菌体。新的噬菌体在侵染其他的细菌后，可将捕捉到的DNA整合到新宿主的基因组上[1]，这一过程被称为转导。目前，P1作为转导工具被广泛应用于基因工程中。P1属于肌病毒科，基因组约有93 kb，被包围在一个二十面体的头部里面[2-3]。在病毒粒子中，它以线性双链DNA分子的形式存在。它的尾部是由6个尾纤维组成的收缩尾[4-5]。在侵染细菌时，噬菌体颗粒利用尾部纤维吸附在细菌表面，并与细菌表面的受体特异性结合。接下来，尾鞘收缩，将线性DNA注入宿主细胞。在DNA被注入后，宿主DNA重组机制或病毒DNA表达重组酶，将末端冗余序列重组，以环化噬菌体基因组。P1可能会进入溶源状态，也可能会立即进入裂解阶段[5]。

P1是在革兰氏阴性菌中被普遍应用的转导工具。P1能够包装供体菌的基因组DNA形成子代的噬菌体。由于噬菌体基因组的高突变性，导致部分的子代噬菌体成为缺陷噬菌体，在侵染受体菌时，不能裂解宿主细胞，而是通过同源重组的方式整合到宿主基因组上。虽然P1作为转导工具具有方便、快速、高效等优点，但是它的使用范围有诸多限制：①对于一些细胞表面覆盖荚膜多糖的细菌，P1不能侵染[6]；②对于一些细胞表面表达O抗原的细菌，P1也不能侵染；③P1的侵染位点被认为位于细胞表面的脂多糖(LPS)的核心上，但是具体是位于哪一位的糖基上，至今还未被发现。

笔者以大肠杆菌Nissle 1917(EcN)为试验菌株。EcN血清型为O6∶K5∶H1，其表达K5荚膜多糖，覆盖在细胞表面[7]。此外，EcN还表达O6抗原。该研究通过λ-RED系统[8]突变其K抗原合成基因来检测K抗原是否影响P1侵染EcN，并逐个突变LPS合成基因，通过检测转导效率的方式来确定P1的侵染位点。

1 材料与方法

1.1材料试验所用试剂均购于生工生物工程(上海)股份有限公司；引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成。大肠杆菌培养所需的抗生素为氨苄青霉素(100 μg/mL)、卡那霉素(50 μg/mL)和氯霉素(25 μg/mL)。噬菌体P1由笔者所在实验室保存。

1.2方法

1.2.1基因敲除。采用λ-RED同源重组系统对EcN进行基因敲除。首先，利用带有待敲除基因两端的39 bp同源臂的引物对，以质粒pKD4/pKD3为模板，PCR扩增带有FRT位点的抗性片段。接下来，将该PCR产物纯化，并电击转化至EcN/pKD46电击感受态细胞中，涂布于相应的抗性平板，30 ℃隔夜培养。抗性平板上筛选出的单克隆菌株用菌落PCR进行验证，以选择出阳性克隆。

1.2.2P1裂解液制备。P1裂解液在大肠杆菌ZK126中制备。首先将隔夜活化的菌液以1%的比例转接至新鲜的3 mL LB培养基中，同时添加10 mmol/L MgCl2、5 mmol/L CaCl2和0.1%葡糖糖，置于37 ℃、220 r/min的摇床中，培养至对数中期。接下来向供体菌中加入100 μL噬菌体P1，37 ℃培养3 h，直至培养基中有细胞残渣出现，且菌液浓度不再升高后，向裂解液中加入100 μL氯仿，振荡混匀10 min，12 000 r/min离心2 min，去除细胞碎片，把上清吸出，存于-4 ℃备用。

1.2.3噬菌体P1转导。首先，用噬菌体P1侵染受体菌，制备包装有受体菌ZK126ΔrecA：：Kan基因组DNA的裂解液。该方法与制备P1裂解液步骤相同。其次，收集2 mL受体菌隔夜培养的菌液，13 000 r/min离心2 min，收集菌体，并加入1 mL 含有10 mmol/L MgSO4、5 mmol/L CaCl2的LB培养基，重悬细胞。接下来，将包装了ZK126ΔrecA：：Kan 基因组DNA的噬菌体P1与受体菌混合，37 ℃静止培养30 min后，加入200 μL 1 mol/L的柠檬酸钠和1 mL无抗LB培养基，置37 ℃、200 r/min的摇床中复苏1 h。复苏后，6 000 r/min离心5 min，收集菌体，加入100 μL含有0.01 mol/L柠檬酸钠的LB液体培养基重悬细胞，涂布到卡那霉素抗性平板上，过夜培养。过夜培养的单克隆由菌落PCR检测以选择出阳性克隆。被选择的阳性克隆转接到含10 mmol/L柠檬酸钠的50 μg/mL卡那霉素抗性平板上划线传代2次后，可保存菌种。

1.2.41H NMR样品制备。首先，将隔夜培养的活化菌液转接至6 L M9培养基中，37 ℃培养20 h。收集菌液上清，用DEAE凝胶柱纯化K抗原。将纯化好的K抗原样品冻干，用0.5 mL D2O溶解。重复冻干、D2O溶解2次。用0.5 mL D2O溶解冻干的样品，加入对苯二甲酸二钠5 μL(共71 μg)溶液作为内参，充分混匀。样品制备好后，将待测样品装入核磁管中，送至合肥工业大学分析测试中心检测。使用Agilent VNMRS 600MHz 核磁共振仪检测，光谱数据用MestReNova软件处理谱图。

2 结果与分析

2.1ZK126ΔrecA：：Kan基因敲除结果该试验选择ZK126ΔrecA：：Kan作为噬菌体P1供体菌。首先，采用λ-RED同源重组系统敲除ZK126的recA基因。以带有卡那霉素抗性基因的pKD4为模板扩增敲除片段，电击转化至ZK126/pKD46电击感受态细胞中。转化后，挑取卡那霉素平板上的单克隆菌株进行菌落PCR检测。泳道1为ZK126野生型菌株，目的条带大小为1 700 bp；泳道2为ZK126ΔrecA：：Kan阳性克隆，目的条带大小分别为1 200 bp和930 bp。由图1可知，结果与预期相符，说明ZK126的recA基因被成功敲除。

图1 ZK126ΔrecA：：Kan菌落PCRFig.1 ZK126ΔrecA：：Kan colony PCR

2.2kfiA基因敲除及K抗原含量检测EcN的K抗原多糖主要由kps基因座负责合成和转运。其中kps基因座分为3个区，负责合成的2区(kfiABCD)以及转运的1区(kpsFEDUCS)和3区(kpsMT)[9]。在负责合成的2区基因中，kfiA表达的蛋白催化葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖的聚合，是合成荚膜多糖的必需基因。因此选择对kfiA基因进行敲除，构建了EcNΔkfiA：：Kan菌株，并通过辅助质粒pCP20表达翻转酶将其卡那霉素抗性基因去除。

1H NMR是近年来发展的一种快捷、准确地检测K5荚膜多糖的方法[10]。为了验证kfiA基因突变株是否能够表达K抗原，通过1H NMR的方法检测野生型和突变株的K抗原(K5多糖)含量。K5荚膜多糖的组成单位是[(→4)β-D-葡萄糖酸(GlcA)(1→4)N-乙酰-α-D-葡萄糖(GlcNAc)(1→)]n重复二糖单元，该二糖在1H NMR共有6个特征峰。其中，位于2.0 ppm处的峰，是由乙酰氨基葡萄糖的甲基氢所出的峰，是K5荚膜多糖最主要的特征峰。由图2可知，EcN野生型菌株的6个K5多糖特征峰均明显出峰，且在图上标出。而EcNΔkfiA菌株没有K5多糖的特征峰，说明EcNΔkfiA菌株不表达K5多糖。

图2 1H NMR检测K抗原含量Fig.2 Detection of K antigen content by 1H NMR

2.3K抗原对P1侵染EcN的影响通过检测P1在侵染某种细菌时是否能够产生噬菌斑，可以直接地观察到P1是否能够裂解该种细菌。用从ZK126制备的P1裂解液同时侵染EcN和EcNΔkfiA，检测P1是否能够裂解EcN和EcNΔkfiA。结果显示，P1在EcN和EcNΔkfiA菌株中均不能产生噬菌斑，说明P1没有将这2种菌裂解(结果没有展示)。EcNΔkfiA菌株是kfiA基因突变株，不能产生K5多糖，说明K5多糖不是影响P1裂解EcN的决定性因素。

为了进一步验证P1能否侵染EcN，将EcN作为P1受体菌进行转导试验。经比对，大肠杆菌ZK126的recA基因上下游100 kb的DNA片段与EcN的同源性较高，因此将ZK126ΔrecA：：Kan作为供体菌，用P1包装其基因组，转导至EcN，将得到的阳性克隆进行菌落PCR检测。由图3可知，电泳条带大小为1 200 bp和930 bp，与预期相同，P1成功将ΔrecA：：Kan片段转导至EcN中。

注：A.菌落PCR检测转导结果；B.抗性平板筛选的转导的阳性克隆Note:A.Colony PCR detection and transduction results;B.Transgenic positive clones screened by resistant plates图3 P1转导ZK126ΔrecA：：Kan至EcNFig.3 P1 transduction of ZK126ΔrecA：：Kan to EcN

2.4O抗原对P1侵染EcN的影响由上述结果可知，P1可以侵染EcN但是不能将其裂解，产生噬菌斑。因此又突变它的O抗原基因以及逐个突变其LPS的糖基转移酶基因，以探究O抗原是否是影响P1裂解EcN的决定性因素，并寻找P1的识别位点。

采用λ-RED同源重组系统敲除了LPS的表面聚合物连接酶基因(waaL)、Hep Ⅱ α-1，3-糖基转移酶基因(waaG)、Glc I α-1，3-糖基转移酶基因(waaO)以及UDP-glucose差向异构酶基因(galE)[11]，并且构建了kfiA与waaG，kfiA与waaO的双基因突变株。为了检测O抗原是否是影响P1裂解EcN的决定性因素，用P1来侵染这6株O抗原的突变株。结果显示，P1仍然不能裂解这一系列的菌株。

2.5转导效率检测据报道，噬菌体侵染细菌的位点很可能位于细菌LPS的核心寡糖上。不同的O抗原基因突变株使得细菌LPS暴露出的寡糖单元也随之不同。用P1转导ZK126ΔrecA：：Kan至构建的O抗原基因突变株中，通过计算转导效率来确定P1的侵染位点。

由图4可知，EcNΔkfiAΔwaaG：：Cm的转导效率最高，EcNΔkfiA的效率第2，EcNΔkfiAΔwaaO：：Cm的效率第3。其余的突变株和EcN野生型作为受体菌的转导效率基本一致。KfiA基因突变株转导效率明显高于野生型，说明包裹在细菌周围的K5荚膜多糖影响P1感染细菌。waaO和waaG单基因突变株会导致LPS核心寡糖在不同的糖单元处中断。waaO突变株会暴露出Glc I，而waaG突变株会暴露出Hep Ⅱ。单基因突变株对于转导效率几乎没有影响，但是在此基础上，再将kfiA基因突变，发现噬菌体P1的侵染效率有明显的提升。尤其EcNΔkfiAΔwaaG：：Cm菌株，转导效率最高，明显高于EcNΔkfiAΔwaaO：：Cm和EcNΔkfiA菌株。由此得出结论：噬菌体P1侵染EcN的识别位点是位于LPS核心寡糖的第2位庚糖上(Hep Ⅱ)。

图4 P1转导recA：：Kan至EcN O抗原突变株结果Fig.4 Results of P1 transduction of recA：：Kan to EcN O antigen mutants

3 讨论

该研究主要通过构建一系列的K抗原和O抗原基因突变菌株来探究P1不能裂解EcN的原因，并且寻找P1侵染EcN的识别位点。用从ZK126菌株制备的P1裂解液来侵染构建的一系列基因突变株，发现结果与P1侵染EcN野生型菌株一致，均不能产生噬菌斑，这说明了K抗原和O抗原均不是P1不能裂解EcN的原因。

据文献报道，P1的识别位点很可能位于LPS的核心寡糖上。不同的O抗原基因突变株会导致LPS核心寡糖的提前中断，暴露出不同的寡糖单元。用P1转导ZK126ΔrecA：：Kan至构建的O抗原基因突变株中，通过计算转导效率来确定P1的侵染位点。结果显示，EcNΔkfiAΔwaaG：：Cm的转导效率最高，EcNΔkfiA的效率第2，EcNΔkfiAΔwaaO：：Cm的效率第3。其余的突变株和EcN野生型作为受体菌的转导效率基本一致。kfiA基因突变株的转导效率均有明显提升，说明覆盖在EcN表面的K5荚膜多糖会影响P1侵染的效率。在将K5荚膜多糖去除后，P1能够更好地与位于K5荚膜多糖内、位于细胞表面的噬菌体识别受体接触，由此导致了转导效率的提升。此外，EcNΔkfiAΔwaaG：：Cm的转导效率明显高于其他2株kfiA基因突变株，说明waaG基因突变株使得Hep Ⅱ暴露了出来，而Hep Ⅱ就是噬菌体P1识别的侵染位点，因此会导致转导效率的升高。因此认为：Hep Ⅱ就是噬菌体P1识别的侵染位点。该研究寻找到了可能的P1识别位点，为P1的后续改造和应用奠定了理论基础。

[1] SINGER M，BAKER T A，SCHNITZLER G，et al.A collection of strains containing genetically linked alternating antibiotic resistance elements for genetic mapping ofEscherichiacoli[J].Microbiological reviews，1989，53(1)：1-24.

[2] IIDA S，ARBER W.Multiple physical differences in the genome structure of functionally related bacteriophages P1 and P7 [J].Molecular & general genetics，1979，173(3)：249-261.

[3] YUN T，VAPNEK D.Electron microscopic analysis of bacteriophages P1，P1Cm，and P7：Determination of genome sizes，sequence homology，and location of antibiotic-resistance determinants [J].Virology，1977，77(1)：376-385.

[4] YARMOLINSKY M B，STERNBERG N.Bacteriophage P1[J].Viruses，1988，1936(3938)：1322.

[5] LIU J，CHEN C Y，SHIOMI D，et al.Visualization of bacteriophage P1 infection by cryo-electron tomography of tinyEscherichiacoli[J].Virology，2011，417(2)：304-311.

[6] SCHOLL D，ADHYA S，MERRIL C.EscherichiacoliK1’s capsule is a barrier to bacteriophage T7 [J].Applied and environmental microbiology，2005，71(8)：4872-4874.

[7] WHITFIELD C.Biosynthesis and assembly of capsular polysaccharides inEscherichiacoli[J].Annual review of biochemistry，2006，75(1)：39-68.

[8] DATSENKO K A，WANNER B L.One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichiacoliK-12 using PCR products[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(12)：6640-6645.

[9] YAN H H，BAO F F，ZHAO L P，et al.Cyclic AMP(cAMP)receptor protein-cAMP complex regulates heparosan production inEscherichiacolistrain nissle 1917 [J].Applied and environmental microbiology，2015，81(22)：7687-7696.

[10] WANG Z Y，ZHANG Z Q，MCCALLUM S A，et al.Nuclear magnetic resonance quantification for monitoring heparosan K5 capsular polysaccharide production [J].Analytical biochemistry，2010，398(2)：275-277.

[11] WHITFIELD C，TRENT M S.Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides [J].Annu Rev Biochem，2014，83：99-128.