腹水脱落细胞DNA倍体对良恶性腹水的诊断价值研究

马 俊，王丽萍，黄 玮，刘毅鹏，上官辉，张继平 *，江 浩，何彩云，

（南方医科大学附属医院佛山消化内科，广东佛山528000））

腹水是临床上常见症状，多数患者以腹水为首发症状来就诊。大部分的腹水由肝硬化、结核性腹膜炎及恶性肿瘤产生。不明原因的腹水中癌性腹水占比最大［1-2］。如何鉴别腹水性质对明确诊断及指导后续治疗意义重大［3］。腹水脱落细胞学病理诊断是良恶性腹水的重要诊断方法，但阳性率不高，仅30%［4］。近年来，发现DNA倍体的异型性与肿瘤的发生发展及临床病理特点密切相关［5］，DNA含量的测定已广泛应用于宫颈癌、胃癌、口腔磷癌等肿瘤的诊断和预后判断［6］。本文收集我院消化内科、血液肿瘤科等收治患者的腹水脱落细胞，采用Feulgen染色及图像分析仪技术（ICM），测定DNA含量及对倍体进行分析，以分析其对良恶性腹水性质的诊断价值，为临床提供一种新的良恶性腹水的诊断方法。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2015年7月-2017年6月我院住院部117例患者腹水，其中经组织病理或细胞学确诊的良性腹水54例，恶性腹水63例；良性腹水中，男性30例，女性24例；年龄46-81岁，平均59.4±17.2岁；其中肝硬化腹水51例，结核性腹水3例；恶性腹水中，男性29例，女性34例，年龄34-83岁，平均年龄61.2±24.9岁，其中消化道肿瘤52例，妇科肿瘤11例。所有患者的诊断均通过胃肠镜下组织病理、手术病理及腹水脱落细胞病理学检查等明确诊断。两组患者性别构成、年龄均无统计学差异。

1.2 DNA倍体检测

1.2.1 腹水脱落细胞收集

收集所有患者腹水，最少200 ml，提取脱落细胞，分成两部分：一部分行细胞学病理诊断，用来协助判断腹水的性质；一部分行脱落细胞的Feulgen染色进行DNA定量分析。

1.2.2 腹水脱落细胞的处理与分析

在脱落细胞收集管（含30 ml固定液）中加入酶消化液，振荡120 min（150次/分），离心5 min（800 rpm），50%乙醇清洗，离心2次，弃上清液，加固定液2～3 ml，振荡，混匀，加200 μl细胞悬液入细胞离心管，离心、甩片5 min，制成液基薄层细胞片3张片，一张做常规染色，行常规病理检查；两张分别做巴氏染色和Feulgen DNA染色，行人工及计算机自动阅片。

所有Feulgen DNA染色片用AcCell全自动细胞DNA倍体分析系统进行扫描分析处理。根据AcCell系统诊断软件所做出的细胞DNA倍体分析判定如下：阴性（-）：以2倍体细胞为主，未见异倍体细胞及异倍体细胞峰；弱阳性（+）：出现DNA指数（DI）＞2.5细胞及DI1-2的细胞数超过被测细胞总数的10%，其中DI＞2.5细胞的细胞数目在1-2个；阳性（++）：DI＞2.5细胞的细胞数目在3-5个；强阳性（+++）：DI＞2.5细胞的细胞数目≥6个。所有DI＞2.5的细胞玻片均由细胞学检查医师在显微镜下逐一进行核实为恶性病例，以排除AcCell系统将破损和重叠的细胞核误认为是癌细胞和异常细胞；同时以病理细胞学核实结果为良恶性为金标准计算DNA倍体分析结果的诊断灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。

1.2.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件，连续型计量资料以x2±s表示，两组间比较采用t检验；等级资料用秩和检验，p＜0.05为差异有统计学意义。诊断性试验的评价指标用诊断灵敏度、特异度、误诊率、漏诊率、阳性预测值、阴性预测值来判定。

2 结果

2.1 脱落细胞DNA倍体分析

在63例恶性腹水中有53例（占84.13%）DNA倍体阳性，54例良性腹水中有8例（占14.81%）DNA倍体阳性。其中在恶性腹水组中，弱阳性病例数为29例、阳性为15例、强阳性者为9例，而在良性腹水组中，8例DNA倍体均为弱阳性，两者等级资料的秩和检验比较差异有统计学意义（μ=7.53，p＜0.001）。

表1 腹水脱落细胞DNA倍体分析结果

2.2 脱落细胞DNA倍体诊断性试验评价结果

如表2所示，63例恶性腹水中53例DNA倍体阳性，10例DNA倍体阴性；54例良性腹水中8例DNA倍体阳性，46例DNA倍体阴性；所有病例中DNA倍体阳性患者61例，DNA倍体阴性患者56例。其脱落细胞DNA倍体诊断灵敏度为84.13%，特异度为85.19%，漏诊率为15.87%，误诊率为14.81%，阳性预测值为86.89%，阴性预测值为82.14%，见表2。

表2 脱落细胞DNA倍体诊断试验表格

2.3 脱落细胞DNA倍体与脱落细胞病理学诊断比较

在恶性腹水中，脱落细胞病理学诊断为恶性的阳性例数共有24例，阴性例数为39例；脱落细胞DNA倍体检测在恶性腹水中，阳性共53例，阴性例数10例；所有病理学诊断为恶性的患者，脱落细胞DNA倍体均为阳性，见表3，其灵敏度为100%，特异度为25.64%，漏诊率为0%，误诊率为74.36%，阳性预测值为45.28%，阴性预测值为100%。这表明脱落细胞DNA倍体的诊断灵敏度高于脱落细胞病理学，具有一定的临床推广应用价值。

表3 恶性腹水中脱落细胞DNA倍体与脱落细胞病理学诊断性试验评价

3 讨论

临床上通常将腹水分为恶性腹水及良性腹水两大类，临床诊断中恶性腹水的诊断金标准腹水脱落细胞学检查为最常用的方法，其诊断特异性为100%，但是敏感性仅有30%左右［4］，为临床诊断带来了一定困难，往往多次行腹水脱落细胞学检查都很难找到癌细胞。本文拟为临床寻找一种简单方便、有效的指标来提高腹水性质的诊断。

DNA倍体的异型性出现与癌变率和癌前病变增生程度有高度相关性，是诊断癌前病变发生癌变的一个重要指标；是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指标；良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA异型性，而恶性肿瘤可出现，以超三倍体或者多倍体居多。研究也表明，DNA倍体异型性不但与肿瘤密切相关，与患者预后也有明显关系［7］。随着计算机技术的发展，定量病理学计算机诊断得以实现，图像分析仪技术（ICM）测定DNA含量已普遍应用于多个领域，如在妇科肿瘤中，通过DNA倍体分析，利于全面了解细胞生物学行为，从而有助于妇科肿瘤的及时诊断、治疗和预后判断［8］。在对早期胃癌的研究也发现，其与胃癌有密切关系，同时对于胃癌组织的恶性程度有重要的临床鉴别诊断意义，同时有助于对肿瘤的动态观察及预后判断［9］。我科前期的研究中也发现脱落细胞DNA倍体对食管良恶性疾病有一定的鉴别诊断价值［10］。

本文研究发现，在恶性腹水中，有10例DNA倍体为阴性，其余均为阳性，阳性率为84.13%；同时在恶性腹水中，24例病例患者脱落细胞病理学为阳性，这部分患者DNA倍体异型性均为阳性，灵敏度为100%，而在39例脱落细胞病理学为阴性的患者中，发现29例患者脱落细胞DNA倍体异型性为阳性，这提示DNA倍体的敏感性明显高于病理细胞学。导致恶性腹水中DNA倍体异型性为阴性者，分析原因可能肿瘤细胞未脱落至浆膜腔、标本中癌细胞聚集成团以及存在高分化的二倍体肿瘤等因素有关；恶性腹水中有9例DNA倍体为强阳性，此9例患者均为肿瘤有广泛腹腔转移，包括肝、腹腔淋巴结、大网膜及腹膜转移。DNA倍体异型性程度及数量是否与肿瘤的转移部位及预后有关，仍需进一步大样本、多中心研究，本文研究结果同杨倩［11］的研究报道一致。

本文采用全自动图像DNA分析仪技术来检测DNA倍体含量，而传统DNA倍体的检测多采用流式细胞仪技术，此方法需要有一定经验的技术人员，多数仅在特殊条件的实验室使用，且其重复性差，对脱落细胞数有一定要求，故多用于科研，很难在临床上推广。而ICM技术具有标本处理简单，能快速获取大量DNA信息，准确率高，并且标本可重复检测，减少了人为因素的影响，易于在临床上广泛开展。有报道对ICM进行细胞核DNA测定有助于提高腹水阳性诊断率，在良、恶性腹水的鉴别诊断中较常规细胞学方法更加客观、敏感［12］。因此，使用ICM方法进行DNA测定，对良恶性腹水鉴别诊断有一定指导意义，可在临床上广泛推广应用。

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