响应面法优化大孔树脂纯化杜仲绿原酸工艺研究

（长春工业大学人文信息学院制药工程系，吉林长春130122）

杜仲（Eucommia ulmoides Olive）为杜仲科杜仲属植物，名贵滋补药材，因其富含黄酮、绿原酸、京尼平苷、丁香素二糖苷、中酯素二糖苷等生物活性物质，从而具有补益肝肾、强筋壮骨、调理冲任、固经安胎之功效[1-2]。特别是主要成分绿原酸由于具有抗菌、降压降脂、保肝利胆、增强机体免疫和美容养颜等保健作用[3]，使得近年以杜仲绿原酸提取物为原料的各类食品在市场不断增多，然而提取物中鞣质、蛋白质等杂质，严重影响绿原酸的纯度，进而影响其食用效果，虽然前人已在其提取与分离作出大量工作，但目标产物纯度仍较为偏低[4-5]。

大孔树脂吸附-洗脱作为经典的分离纯化技术，具有选择性高、干扰因素少、可重复循环利用等特点，已广泛用于食品、医药、农业等诸多领域[6-8]。本研究在绿原酸提取工艺基础上，借鉴响应面法试验设计原理，采用紫外-可见分光光度法定量分析，探讨杜仲绿原酸最佳纯化工艺，为其后续开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杜仲干燥叶：亳州道兴堂药材销售有限公司；绿原酸（定量分析用）：中国药品生物制品检定所；乙醇、石油醚（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；试验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

722型分光光度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；AE224型电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；878-A/B型高速多功能粉碎机：常州国华电器有限公司；H-107、DM-130型大孔树脂：陕西蓝深特种树脂有限公司；ADS-5、ADS-17、ADS-21 型大孔树脂：沧州宝恩吸附材料科技有限公司；NKA-9型大孔树脂：南开大学化工厂；RE-201D旋转蒸发仪：瑞德仪器设备有限公司；SJIA-5FE冷冻干燥机：宁波双嘉仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

取干燥杜仲叶粉碎完全，过60目筛，称取40 g，采用70%乙醇溶液回流提取2次，每次1 h，回收乙醇后，置于分液漏斗中，加入石油醚萃取至上层溶液近无色，取下层水液于40℃减压浓缩后，冷冻干燥备用[9]。

1.3.2 测定方法标准曲线绘制[10]

分析天平精密称取绿原酸标准品0.2 g，用70%乙醇分别配制浓度为 0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mg/mL 标准品溶液，以70%乙醇溶液作空白溶剂，于328 nm最大吸收波长下测定各自吸光度，绘制绿原酸浓度（X）-吸光度（Y）的标准曲线，线性方程为：Y=1.025 X-0.104（r=0.9932），表明绿原酸浓度在0.1 mg/mL～1.0 mg/mL时，吸光度与其线性关系良好。

1.3.3 树脂预处理

将大孔树脂24 h浸泡于90%乙醇中，充分溶胀后湿法装柱，后用90%乙醇反复冲洗，直至流出液与水混合（体积比为=1∶5）无白色浑浊出现，再用水洗至无乙醇气味，加入3%盐酸浸泡3 h，用水洗至中性；再用3%氢氧化钠溶液浸泡3 h，用水洗至中性，备用[11]。

1.3.4 树脂型号选择

称取2.0 g 6种极性不同的大孔树脂（H-107、ADS-5、DM-130、ADS-17、NKA-9、ADS-21）置于锥形瓶内，分别加入等浓度的杜仲绿原酸提取液50 mL后，放入振动器中，静态吸附24 h，使大孔树脂吸附绿原酸饱和，随后过滤，蒸干滤液。通过下式计算得到不同类型大孔树脂静态饱和吸附量与吸附率。

式中：m0为提取液绿原酸质量，mg；me为饱和吸附后滤液中绿原酸质量，mg；m为干燥的大孔树脂质量，g；Γe为静态饱和吸附量，mg/g；Qe为静态饱和吸附率，%。

将过滤后的树脂置于锥形瓶内，加入70%乙醇30 mL，放于振荡器中，静态洗脱24 h，过滤，测定滤液绿原酸含量，通过下式计算不同类型树脂的洗脱率与回收率。

式中：m0为提取液绿原酸质量，mg；me为饱和吸附后滤液中绿原酸质量，mg；md为洗脱液绿原酸质量，mg；Dd为静态洗脱率，%；R 为回收率，%。

1.3.5 单因素试验

1.3.5.1 上样液质量浓度影响

分别配制20 mL杜仲绿原酸提取液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mg/mL，控制上样流速 3.0 BV/h，加入至预处理后的DM-130型大孔树脂内，收集柱后流出液，分别测定其绿原酸含量。

1.3.5.2 洗脱液浓度影响

杜仲绿原酸极性较大，因此选择一定浓度的乙醇溶液作为洗脱剂，然而乙醇溶液浓度过高，易使得柱内残余极性较小的杂质被洗脱，浓度过低又导致绿原酸不易洗脱完全，因此选择合适的洗脱液浓度尤为重要。按前述最佳条件上样后，分别采用5.0 BV的40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，以2.0 BV/h流速洗脱，收集洗脱液，分别测定其绿原酸含量。

1.3.5.3 洗脱液体积影响

将50 mL浓度为3 mg/mL的杜仲绿原酸提取液，以3.0 BV/h上样至预处理后的大孔树脂柱内，吸附结束后，采用体积分别为 3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 BV 的50%乙醇溶液，以2.0 BV/h流速洗脱，收集洗脱液，分别测定其绿原酸含量。

1.3.5.4 洗脱流速影响

洗脱流速越慢，洗脱液对树脂吸附的绿原酸洗脱效果越好，分别对 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h 的洗脱液流速进行洗脱率考察。按照前述最佳条件上样后，采用5.0 BV 50%乙醇溶液照上述5种不同洗脱流速对吸附的绿原酸洗脱，收集洗脱液，分别测定其绿原酸含量。

1.3.5.5 上样流速影响

配制3.0 mg/mL杜仲提取液50 mL，分别控制上样流速 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 BV/h，加入至预处理后的DM-130型大孔树脂内，收集柱后流出液，分别测定其绿原酸含量。

1.3.6 响应面试验

在单因素试验基础上，利用Design-Expert 8.0.6.1软件的Box-Behnken试验设计原理，以上样液质量浓度（A）、洗脱液浓度（B）、洗脱液体积（C）、洗脱流速（D）、上样流速（E）为响应因素，回收率（Y）为响应值，进行五因素三水平的响应面（response surface methodology，RSM）分析试验，确定杜仲绿原酸的最佳纯化工艺。

2 结果与分析

2.1 提取物中绿原酸含量测定

以70%乙醇溶液作为空白对照，精密称取杜仲绿原酸提取物0.5 g，用70%乙醇溶液定容于100 mL容量瓶中于328 nm波长处测定吸光度，平行测定3次，代入标准曲线方程，计算样品含量，测定结果见表1所示。

表1 杜仲提取物中绿原酸含量Table 1 The content of chlorogenic acid of Eucommla ulmoides extract

2.2 树脂型号选择

表2为不同类型树脂的静态吸附与洗脱性能比较。从表2可知，DM-130型大孔树脂的回收率均高于其它5类树脂，达到80.6%，这归因于绿原酸的化学结构上含有羧基和羟基，具有一定的极性，DM-130型大孔树脂特殊的空间结构与弱极性，恰好与绿原酸产生较好的物理吸附，因此确定其作为纯化杜仲绿原酸的吸附树脂。

表2 不同类型树脂的静态吸附与洗脱性能比较Table 2 Comparison of static adsorption and desorption performance of different macroporous resins

2.3 静态吸附动力学

根据“1.3.4”中静态吸附试验条件，在不同时间段测定DM-130型大孔树脂静态吸附绿原酸质量，绘制静态吸附动力曲线，见图1所示。

图1 DM-130型大孔树脂静态吸附动力曲线Fig.1 Static adsorption curve of DM-130 macroporousresin

树脂对绿原酸吸附量随着时间的增长而增大，在8 h左右趋于饱和，DM-130型大孔树脂静态吸附杜仲提取物中绿原酸耗时理想，能够满足相关工业生产要求。

2.4 单因素试验

2.4.1 上样液质量浓度影响

不同上样液质量浓度对绿原酸吸附率的影响，见图2所示。

从图2可见，当上样液质量浓度为5.0 mg/mL时，树脂对绿原酸的吸附率达到89.2%，继续增大上样液浓度，吸附率开始下降，因此选择4.5、5.0、5.5 mg/mL作为上样液质量浓度的响应因素水平。

2.4.2 洗脱液浓度影响

不同洗脱液浓度对绿原酸洗脱率的影响，见图3所示。

从图3可知，当洗脱液为60%乙醇溶液，绿原酸洗脱率达到平衡，因此选择55%、60%、65%作为洗脱液浓度的响应因素水平。

图2 上样液质量浓度对绿原酸回收率影响Fig.2 Effect of loading solution concentration on the recovery of chlorogenic acid

图3 洗脱液浓度对绿原酸回收率影响Fig.3 Effect of concentration of eluent on the recovery of chlorogenic acid

2.4.3 洗脱液体积影响

不同洗脱液体积对绿原酸的洗脱率影响，见图4所示。

图4 洗脱液体积对绿原酸回收率影响Fig.4 Effect of volume of eluent on the recovery of chlorogenic acid

从图4可见，当洗脱液体积为7.0 BV时，洗脱率达到平衡，因此选择6.5、7.0、7.5 BV作为洗脱液用量的响应因素水平。

2.4.4 洗脱流速影响

不同洗脱流速对绿原酸洗脱率的影响，见图5所示。

图5 洗脱流速对绿原酸回收率影响Fig.5 Effect of flow rate of eluent on the recovery of chlorogenic acid

从图5可见，随着洗脱流速的增大，洗脱率不断减小，考虑生产时间，选择1.5、2.0、2.5 BV/h作为洗脱流速的响应因素水平。

2.4.5 上样流速影响

不同上样流速对绿原酸吸附率的影响，见图6所示。

图6 上样流速对绿原酸回收率影响Fig.6 Effect of flow rate of sample solution on the recovery of chlorogenic acid

从图6可见，树脂对绿原酸的吸附率随着流速的增大而减小，但流速过低，会延长吸附时间，因此综合考虑，选择2.5、3.0、3.5 BV/h作为上样流速的响应因素水平。

2.5 响应面法分析

根据单因素试验结果，各响应因素水平见表3所示。表4为试验设计方案与响应结果，对表4进行多元回归拟合，得到以回收率为目标函数，关于各参数编码值的二次回归方程：

Y=90.18+0.28A+0.062B+0.10C+0.36D+0.33E+0.50AB-0.15AC-0.05AD+0.23AE-0.10BC-0.075BD-0.27BE-0.10CD+0.50CE+0.025DE-0.40A2-0.60B2-0.84C2-0.25D2-0.48E2，对该模型进行显著性检验，并进行可信度分析，结果见表5所示。

表3 响应面分析因素及水平Table 3 Factors and levels of response surface design

表4 Box-Behnken设计方案及结果Table 4 Design and results of the Box-Behnken

续表4 Box-Behnken设计方案及结果Continue table 4 Design and results of the Box-Behnken

表5 回归方程方差分析Table 5 Variance analysis for the fitted regression mode

从表5可知，该回归模型P＜0.01，表明该回归模型对绿原酸回收率具有较好的预测性，同时R2=0.9074与Adj.R2=0.8332都接近于1，表示该模型可靠程度较高，试验误差小。变异系数小于1%，说明模型外因素对响应值的影响较小，从而该回归方程可替代实际值对结果进行分析。一次项A、D、E对绿原酸回收率的影响显著，二次项 B2、C2、D2、E2对试验影响结果影响显著，交互项AB、BE、CE对结果影响显著，其它交互项影响均不显著。从F值可知，影响绿原酸回收率的强弱顺序为：洗脱流速＞上样流速＞上样液质量浓度＞洗脱液体积＞洗脱液浓度。

2.6 响应面模型分析

图7反映了各两因素交互作用的响应面。

图7 各两因素交互作用的响应面Fig.7 Response surface of different two factors interaction

通过解二次多项回归拟合方程得到最优条件为：将质量浓度为5.5 mg/mL的杜仲绿原酸提取液，以2.45 BV/h流速上样至DM-130型大孔树脂内，随后采用7.5BV的55%乙醇溶液，以1.87 BV/h流速洗脱，预测最大回收率为90.7%。

2.7 验证性试验

为了验证响应面法所得最佳纯化工艺和可实施性，通过试验确定最佳纯化工艺参数。将质量浓度为5.5 mg/mL的杜仲绿原酸提取液，以2.5 BV/h流速上样至DM-130型大孔树脂内，随后采用7.5 BV的55%乙醇溶液，以2.0 BV/h流速洗脱，收集洗脱液，定量分析绿原酸含量，结果见表6所示。

表6 纯化前后提取物中绿原酸含量Table 6 The content of chlorogenic acid of extracts before and after purification

从表6可知，绿原酸回收率平均值与预测值较为接近，回收率为90.5%，表明采用响应面法优化得到的杜仲绿原酸提取物纯化参数准确可靠，对相关工业生产具有一定指导作用。提取物中绿原酸含量由纯化前134.5 mg/g，提高至纯化后341.2 mg/g，为纯化前的2.5倍。

3 结论

本研究选用6种大孔树脂纯化杜仲提取物中绿原酸，响应面法结果表明：配制5.5 mg/mL的杜仲提取物，以2.5 BV/h流速，上样至DM-130型大孔树脂中吸附，随后采用7.5 BV的55%乙醇溶液，以2.0 BV/h流速洗脱，绿原酸回收率为90.5%，所得洗脱液绿原酸含量为纯化前的2.5倍。该工艺操作简便、纯化效率较高，从而适合推广于相关工业应用。

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