利拉鲁肽对肥胖相关性肾病的作用以及与自噬通路的关系

李 娜，郭晶晶，霍琴琴，潘天荣，钟 兴

肥胖相关性肾病(obesity-related glomerulopathy，ORG)是由于肥胖引起机体一系列代谢问题，并由此导致的肾脏病变。利拉鲁肽为胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)类似物，与天然的GLP-1有97%的同源性，具备GLP-1全部生理作用[1]。研究[2]显示GLP-1能保护肾脏、减轻糖尿病肾病患者蛋白尿症状，延缓糖尿病肾病的进展，但是对于ORG的作用，目前尚不明确。自噬是真核细胞内的蛋白质大分子、细胞器等在自噬溶酶体的作用下被降解的过程。通过研究特异性足细胞Atg5基因敲除小鼠显示，自噬可以保护肾脏并且减少蛋白尿的产生[3]。该研究通过观察ORG小鼠模型的肾脏病理学、血清学指标和尿微量白蛋白，评价利拉鲁肽对ORG的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF级C57BL/6J雄性小鼠34只，(19.04±0.37)g，购自南京大学-南京生物医药研究所。随机分为正常对照组12只，高脂组22只。

1.1.2主要药物、器材与试剂 利拉鲁肽(商品名诺和力)购自丹麦诺和诺德公司(批号：FP51752-2)；ELISA测定试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司；Western blot试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；ADVIA 2400全自动生化分析仪购自德国西门子公司。

1.2实验方法

1.2.1动物模型的建立 小鼠适应性喂养10 d后，随机分为正常对照组12只，高脂组22只，正常对照组予以普通饲料喂养，高脂组予以高脂饲料喂养，高脂饲料配方为猪油6%，胆固醇2%，蛋黄粉10%，胆盐0.2%，基础饲料81.1%，购自江苏省协同生物工程有限责任公司。高脂喂养12周后，在高脂组及正常对照组随机各选取2只小鼠处死，肾脏病理提示高脂组造模成功，将高脂组随机分为利拉鲁肽组10只及肥胖组10只，并继续予以高脂饮食，利拉鲁肽组予以皮下注射利拉鲁肽0.6 mg/(kg·d)，肥胖组予以生理盐水0.6 mg/(kg·d)，每周测量小鼠体质量，根据体质量变化调整药物剂量，干预12周，期间正常对照组一直予以普通饲料喂养，各组小鼠自由进食水，标准鼠笼饲养，每笼4～5只，温度在20～25 ℃，12/12 h光照黑暗循环(光照时间7:00-19:00)。

1.2.2标本采集 使用小鼠代谢笼收集小鼠24 h尿液，记尿量，离心后取上清液测小鼠24 h尿微量白蛋白。干预至12周末，称取小鼠体质量，内眦取血，离心后取上清液，将小鼠断头处死，迅速取出双侧肾脏，观察双肾大小形态，称取右肾湿重后，切取部分组织用10%的中性福尔马林固定，行石蜡包埋切片，用于HE等染色，余肾脏组织放置-80 ℃冰箱，用于Western blot实验。

1.2.3指标测定 采用HE、PAS染色观察肾脏病理变化；采用ELISA测定小鼠尿微量白蛋白；采用全自动生化分析仪测定小鼠血脂，包括胆固醇(cholesterol，CHO)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low densith lipoprotein，LDL)；采用Western blot法测定小鼠肾脏组织的自噬通路相关因子沉默信息调节因子1(silent information regulator 2，SIRT-1)和AMP依赖的蛋白激酶(adenosine 5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)、微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein1 light chain 3, LC3)，以及自噬活性标志物泛素结合蛋白P62的表达。

2 结果

2.1小鼠体质量、右肾湿重及24h尿微量白蛋白变化与正常对照组相比，肥胖组小鼠体质量明显增加，而在利拉鲁肽干预12周后，小鼠体质量较肥胖组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比，肥胖组小鼠尿微量白蛋白明显升高，利拉鲁肽干预12周后尿微量白蛋白较肥胖组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2各组小鼠血TG、CHO和LDL的变化肥胖组TG、CHO、LDL较正常对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；利拉鲁肽干预12周后，TG、CHO、LDL较肥胖组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 各组小鼠24 h尿白蛋白、体质量及右肾湿重的变化

与正常对照组比较：*P<0.05，与肥胖组比较：#P<0.05

表2 各组小鼠血清TG、CHO、LDL变化

与正常对照组比较：*P<0.05，与肥胖组比较：#P<0.05

2.3各组小鼠肾脏组织病理变化小鼠肾脏HE及PAS染色显示，与正常对照组小鼠相比，肥胖组小鼠肾脏肾小球肥大、系膜基质增多显著，伴有局灶节段性硬化，而在利拉鲁肽干预12周后，肾小球肥大、局灶节段性硬化及系膜基质增多明显改善，见图1。

2.4各组小鼠肾脏自噬通路相关因子SIRT-1、P-AMPK、LC3B、P62蛋白含量比较Western blot法检测结果显示，与正常对照组相比，肥胖组SIRT-1、P-AMPK/AMPK、LC3B含量明显下降，P62含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与肥胖组相比，利拉鲁肽组SIRT-1、P-AMPK、LC3B含量明显上升，而P62含量下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

3 讨论

随着经济水平的快速发展和生活方式的改变，肥胖的发病率日益增加，肥胖可对包括肾脏在内的多个重要器官造成病理损害[4]。Bonnet et al[5]报道了162例IgA肾病患者20年随访，肾活检时发现在BMI≥25kg/m2的患者中，肾病理改变及肾功能恶化更明显。肥胖的流行导致ORG流行性大幅度增加，ORG早期表现为肾小球滤过率增加及微量白蛋白尿，随着病情进展可出现不同程度蛋白尿，最终可发展为肾功能不全。ORG主要的组织学特点包括肾小球肥大伴或不伴肾小球局灶节段性硬化，系膜基质增加及系膜细胞增殖等[6]。

2001年首次公开利拉鲁肽的动物实验结果，显示给肥胖大鼠模型注射利拉鲁肽可有效减轻肥胖个体的体质量[7]。研究[8]表明，在利拉鲁肽干预治疗4周后，大鼠血清TG、CHO水平明显下降。与上述研究结果一致，本研究也显示，在肥胖组中，小鼠体质量、右肾湿重及血清TG、CHO、LD指标均明显升高，利拉鲁肽干预12周后，小鼠体质量、右肾湿重及血脂水平较肥胖组均显著下降。一项564例肥胖患者的双盲、随机对照研究[9]表明，利拉鲁肽能显著降低肥胖患者的体质量。

动物模型研究[10]显示，GLP-1受体激动剂可有效改善糖尿病大鼠的肾小球肥大，系膜增生及肾小球硬化。本研究在ORG小鼠模型中也观察到，在肥胖组小鼠中，肾脏出现明显的肾小球肥大，伴有局灶节段性硬化，系膜基质增多，肥胖组小鼠24 h尿微量白蛋白明显升高，而在利拉鲁肽干预12周后，小鼠肾脏病理变化及24 h尿微量白蛋白均明显改善。提示利拉鲁肽对ORG有显著的改善。

图1 各组小鼠肾脏组织病理变化 ×400

图2 各组小鼠肾脏组织自噬相关蛋白变化

A：P-AMPK/AMPK ;B:LC3B;C:P62;D:SIRT-1;1:正常对照组;2:肥胖组;3:利拉鲁肽组;与正常对照组比较：*P<0.05;与肥胖组比较：#P<0.05

自噬在清除废物，结构重建，细胞生长发育，蛋白代谢平衡维持和细胞内环境稳定中有重要作用[11]。自噬可受营养感受信号如SIRT-1、mTOR和AMPK的调节。目前有多项研究[12]显示，SIRT-1与AMPK关系密切，白藜芦醇通过SIRT-1刺激AMPK，改善线粒体功能，SIRT-1/AMPK是自噬的经典通路。AMPK是自噬的上游调节因子，AMPK的丧失导致自噬缺陷[13]；微管相关蛋白轻链3(LC3)是一种自噬相关蛋白，有LC3I和LC3II(LC3B)两个亚型；与LC3I相比，LC3II定位于自噬泡膜上，对于评价自噬活性更为敏感。P62是自噬的另一种相关蛋白，当自噬低或缺乏时，会发生P62聚集的积累[14]。肾小球足细胞在生理状态下就有较高水平的自噬，自噬抑制剂或敲除自噬相关基因的足细胞的滤过功能降低[15]。相关研究[16]显示在高脂诱导的小鼠肝脏中，GLP-1受体激动剂艾塞那肽通过上调SIRT-1和AMPK磷酸化而改善脂肪肝，在肾脏组织中，GLP-1受体激动剂发挥作用是否与SIRT-1/AMPK通路有关尚不清楚。本研究显示，与正常对照组相比，肥胖小鼠的肾脏中自噬通路蛋白SIRT-1、P-AMPK以及LC3B蛋白明显下降，而P62蛋白的累积明显增多，提示在肥胖小鼠中，自噬活性明显降低；而在利拉鲁肽干预12周后，肾脏自噬通路蛋白SIRT-1、P-AMPK以及LC3B明显升高，P62的累积明显下降，提示利拉鲁肽保护ORG的肾脏，机制可能与改善肾脏的自噬活性有关。

综上所述，从血清学、尿液学检查、肾脏病理学检查及Western blot检测得出，GLP-1受体激动剂利拉鲁肽能够改善ORG微量蛋白尿和肾脏病理改变，可能与诱导ORG小鼠的自噬活性增加有关，利拉鲁肽有可能成为治疗ORG患者的新型药物。

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