张 魁,娄 寅,谢 娟,李红红,曹东升
婴幼儿血管瘤是一种由异常增生的血管和不成熟的血管细胞组成的良性肿瘤。其生物过程概括为毛细血管的异常增生及自行消退[1],原病灶处血管瘤组织可溃疡出血或萎缩后形成瘢痕组织或者纤维脂肪组织[2]。近年来,婴幼儿血管瘤干细胞(hemangiomas stem cells, HemSCs)被证实作为婴幼儿血管瘤的起源细胞参与其生物学过程,有较高的增殖和分化能力。胰岛素样生长因子-2(insulin-like growth factor 2, IGF-2)是一种小却有多重功能的多肽,在肿瘤生长及调控各种生物学功能中有重要作用[3]。已有研究证实IGF-2在脂肪形成过程中明显上调[4],而且IGF-2在增生期血管瘤组织中高表达[5],IGF-2有三种受体:胰岛素样生长因子-2受体(insulin-like growth factor 2 receptor, IGF-2R)、胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R)、胰岛素受体(insulin receptor, IR),其中IGF-1R主要通过PI3K/AKT通路调节脂肪分化[6],提示IGF-2可能通过IGF-1R参与婴幼儿HemSCs的脂肪转化。该研究旨在探讨IGF-2是否通过IGF-1R调节PI3K/AKT通路进而影响HemSCs的成脂转化。
1.1组织来源增生期草莓状婴幼儿血管瘤组织标本均来源于安徽医科大学第二附属医院整形外科临床诊断明确的患者。全部取得患者家属同意并签署知情同意书,术后组织标本3例,患者术前均未经任何治疗。
1.2主要试剂与仪器胶原酶(德国 Serva公司);EGM-2培养基(美国 LONZA公司);CD133免疫磁珠试剂盒(德国 Miltenyi生物技术有限公司);DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS(美国 HyClone 公司);胰蛋白酶(上海碧云天生物技术研究所);CCK-8试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司);IGF-2(美国 Peprotech公司);OSI-906(美国 Selleck公司);LY294002(美国 MCE公司);C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、adiponectin抗体(中国 Bioss公司);p-AKT、total AKT抗体(美国 CST公司);MS分选器、MS分选柱(德国 Miltenyi生物技术有限公司)。
1.3方法
1.3.1HemSCs原代提取与培养 3例增生期草莓状婴幼儿血管瘤组织装于DMEM/10% FBS+1%双抗培养液的50 ml无菌离心管,迅速带回实验室,超净台无菌PBS清洗3次后,无菌眼科剪分别剔除脂肪、皮肤、血凝块及其他非血管瘤组织,残留鲜红色血管瘤组织团块,放于0.2%胶原酶中剪碎至1 mm3大小,37 ℃水浴消化2 h至乳糜状,加基础培养基中和,300 r/min 离心10 min,再次离心后弃上清,加DMEM重悬,100目金属网过滤三次后收集细胞悬液,细胞计数,每108个细胞,加300 μl灭菌PBS,100 μl FcR封闭液,100 μl CD133免疫磁珠标记,混匀后4 ℃避光孵育30 min。安装好分选柱无菌PBS润湿3次,分选柱过滤,搜集分选柱内免疫标记细胞再次细胞计数,调整细胞浓度接种于培养皿中,37 ℃、5% CO2培养箱内孵育,长满至80%左右传代,3~15代内细胞用于实验。
1.3.2CCK-8法检测IGF-2对HemSCs增殖的影响 对数期HemSCs调整浓度至2×103/孔接种于96孔板,饥饿24 h,设置5组(EBM-2/5% FBS):10、20、100、200 ng/ml IGF-2实验组和空白对照组,每组3个复孔,培养箱孵育72 h,各组加入CCK-8试剂,酶标仪检测490 nm下各孔吸光度(OD)值。为进一步研究其生长动力学,HemSCs调整浓度为1.5×103/孔,饥饿24 h,每孔加入100 ng/ml IGF-2(5% FBS), CCK-8试剂分别于第0、1、3、5、7天加入,37 ℃孵育,4 h后测490 nm下各孔OD值。实验均重复3次。并选取合适药物浓度进行下一步实验。
1.3.3Western blot检测各组HemSCs中C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、 adiponectin及p-AKT、total AKT的蛋白表达 收集各实验组及空白对照组细胞,提取细胞总蛋白,BCA蛋白定量,根据蛋白浓度设定上样量浓度,稀释后蛋白加热变性,经凝胶电泳分离,将蛋白转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h, C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、adiponectin、p-AKT、total AKT抗体均按照1:1 000稀释,4 ℃孵育过夜,配制二抗1:10 000稀释,室温孵育1 h。每步骤之间均TBST洗膜10 min×3次。加ECL发光显影试剂曝光后保存图片,β-actin作为内参,所有条带均进行灰度值分析。
2.1IGF-2促进HemSCs增殖不同浓度的IGF-2处理HemSCs后,CCK-8结果显示:IGF-2在体外对HemSCs增殖有促进作用。与空白对照组相比,浓度在100~200 ng/ml时对HemSCs的增殖有明显促进作用,差异有统计学意义(F=19.93,P<0.05),在100 ng/ml时对HemSCs的促进作用最明显,差异有统计学意义(P<0.05),见图1。对于细胞生长曲线,细胞在100 ng/ml组时比其他组更有活力,IGF-2处理后的细胞在第3~7天时OD值明显增加,差异有统计学意义(F=28.72,P<0.05)。见图2。为了方便进一步实验,后续实验组IGF-2浓度均选用100 ng/ml。
2.2IGF-2促进HemSCs中脂肪转化因子C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、adiponectin的表达Western blot结果显示:β-actin作为内参,IGF-2处理72 h后,实验组中C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和adi-ponectin的表达增加,明显高于空白对照组;同时IGF-2+OSI-906组、IGF-2+LY294002组、LY294002组中脂肪转化因子表达量明显低于IGF-2组;LY294002组中脂肪转化因子表达量明显低于空白对照组。见图3。以上结果表明IGF-2在体外可促进HemSCs向脂肪转化。IGF-1R受体抑制剂(OSI-906)、PI3K抑制剂(LY294002)均可抑制IGF-2诱导的HemSCs成脂转化。
图1 不同浓度IGF-2对HemSCs增殖的影响
1:空白对照组;2~5:10、20、100、200 ng/ml IGF-2组;与空白对照组比较:*P<0.05;与100 ng/ml IGF-2组比较:#P<0.05
图2 IGF-2处理后HemSCs的生长曲线
与空白对照组比较:*P<0.05,**P<0.01
2.3IGF-2及IGF-1R受体抑制剂对PI3K通路的影响Western blot结果显示,β-actin作为内参,IGF-2组处理1 h后,实验组中AKT磷酸化表达增加,明显高于空白对照组;IGF-2+OSI-906组、IGF-2+LY294002组处理后,AKT磷酸化水平明显减少低于IGF-2组,差异有统计学意义(P<0.05),见图4。以上结果表明IGF-2可促进HemSCs中PI3K/AKT通路活化,IGF-1R受体抑制剂(OSI-906)可抑制PI3K/AKT通路的活化。
1:空白对照组;2:IGF-2组;3:IGF-2+OSI-906组;4:IGF-2+LY294002组;5:LY294002组;与空白对照组比较:*P<0.05;与IGF-2组比较:#P<0.05
图4 Western blot 法检测蛋白的表达情况
1:空白对照组;2:IGF-2组;3:IGF-2+OSI-906组;4:IGF-2+LY294002组;与空白对照组比较:*P<0.05;与IGF-2组比较:#P<0.05
婴幼儿血管瘤是一种微血管性的良性肿瘤,大多数婴幼儿血管瘤会随着时间的推移而自发消退,其中消退期瘤体内紊乱的血管和不成熟的血管细胞被纤维脂肪组织替代。HemSCs作为婴幼儿血管瘤的起源细胞,已经成为研究婴幼儿血管瘤生物学特性的热点[1]。在婴幼儿血管瘤自发性转归为纤维脂肪组织过程中,HemSCs增殖及脂肪分化的具体机制尚未明确。
IGF-2作为一种促有丝分裂原,具有凋亡抑制作用,研究者采用cDNA微集阵列分析方法证实IGF-2是血管瘤生长潜在的重要调节因子,通过建立人血管瘤的外植模型,表明IGF-2可促进血管瘤在体外生长[5,7]。本研究通过CCK-8法发现IGF-2在体外能够明显增加HemSCs的增殖能力并且呈剂量依赖性。IGF-2作为调控因子在调节肿瘤生长及各种生物学功能中,有三种受体可结合并发挥不同功能,其中IGF-2R没有内在的催化活性,可以作为一种膜结合IGF结合蛋白可灭活IGF-2[8],IR参与葡萄糖稳态的维持,IGF-1R可调节细胞增殖、分化、迁移、抑制细胞凋亡[9]。研究表明IGF-2可参与机体脂肪转化及脂质堆积过程[4],同时IGF-2可促进成年大鼠骨细胞的增殖及脂肪转化[10]。推测IGF-2可能对HemSCs的脂肪分化有一定作用。同时脂肪生成受到转录因子的密切调控,包括PPAR和CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)家族[11]。C/EBPs在调节前脂肪细胞分化中有不同作用,C/EBPβ作为前脂肪细胞脂肪分化中遗传级联组成部分,可加速促进C/EBPα的作用[12],C/EBPα作为转录因子与PPARγ联合可明显促进脂肪分化过程, 脂联素(adiponectin)又通过PPARγ途径促进前脂肪细胞分化[13]。本研究Western blot结果显示IGF-2组处理后HemSCs中脂肪转化因子C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和 adiponectin表达量明显高于空白对照组,IGF-2+ OSI-906组处理后上述脂肪转化因子表达量明显低于IGF-2组。同时,有研究[14-15]表明PI3K/AKT通路作为IGF-1R通路的下游参与脂肪转化。在3T3-L1前脂肪细胞中,PI3K抑制剂(LY294002)明显抑制了脂肪细胞的分化[16]。本研究Western blot结果显示IGF-2+LY294002组处理后上述脂肪转化因子表达量明显低于IGF-2组,且LY294002组处理后上述脂肪转化因子表达量明显低于空白对照组。为进一步探索IGF-2及IGF-1R对PI3K/AKT通路的影响,本研究Western blot结果显示IGF-2组处理后p-AKT表达量明显高于空白对照组,IGF-2+OSI-906组和IGF-2+LY294002组处理后p-AKT表达量明显低于IGF-2组。上述研究进一步证实了IGF-2可能通过IGF-1R调节下游PI3K/AKT通路影响HemSCs脂肪转化。
综上所述,IGF-2在体外可促进婴幼儿HemSCs的增殖及向脂肪分化,其脂肪分化的机制可能是与IGF-1R诱导的PI3K/AKT通路活性有关。
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