双孢菇多糖的提取及抗氧化活性研究

刘杨，赵立，蒋长兴，陈军，白青云，毕艳红，陈文

（淮阴工学院生命科学与食品工程学院，江苏淮安223003）

食用菌是已知最早的、人类实践中发现并利用的一类微生物，其医学价值在我国东汉时期已有记录。食用菌素有“植物肉”之称，蛋白质含量丰富，有18种L-氨基酸，氨基酸组成合理。双孢菇（Agaricus bisporus），是一种常见的食用菌，又称白色蘑菇、洋蘑菇、圆蘑菇、银白色菌丝菇，是中低温性真菌，生长速度快，不容易结菌被，实体多单生，形状圆正，呈白色、外周没有鳞片，菌盖较厚，菇体肉质肥厚。在双孢菇的担子上面，一般都会有两个担孢子长在上面，得名双孢菇[1,2]。

真菌多糖是多数食用菌含有的一种非常重要的活性成分，具有广阔的发展前景，近年来受到国内外学者的广泛关注[3-5]。真菌多糖具有很好的抗氧化性，是一款天然存在的大众消费品，方便易得。作为天然绿色防腐剂，在食品中的应用已被大众所接受和认可[6-9]。目前也被应用到化妆品的开发与成分添加中，本文应用真菌多糖来优化双孢菇多糖的提取工艺，并分析了它的抗氧化活性，为双孢菇多糖的充分应用，发挥多糖的医药价值提供参考。

1 材料与设备

1.1 试验材料

新鲜双孢菇选自淮安市城南市场，市售。菌体肉质饱满，没有划痕，颜色白净，无褐色或黑色斑点，菌体上的菌杆未脱落。

1.2 试剂

苯酚、浓硫酸、无水乙醇、氯化铁、三氯乙酸、铁氰化钾、EDTA、VC、Ferrozine（菲洛嗪）等，均为分析纯。BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）为食品级。

1.3 设备

PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；723-UV-5800型紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 操作流程及主要步骤

2.1.1 粉碎、浸提、浓缩

将双孢菇切片置于粉碎机中粉碎后，置于匀浆机中加水匀浆，采用热水浸提。过滤，得浸提液。将浸提液在8000r/min条件下离心15min，得到上层清液。将得到的上层清液用旋转蒸发器浓缩，减压浓缩至原体积的1/3～1/2。

2.1.2 醇沉、离心、干燥

将浓缩液加3倍体积乙醇，搅拌，放置一夜，然后8000r/min离心15min，得沉淀物。将沉淀物置于烘箱中，（105±2）℃条件下烘至恒重，捣成粉末备用。

2.2 双孢菇多糖提取优化工艺试验

2.2.1 单因素试验

（1）提取温度对多糖提取率的影响

选择不同温度（50、60、70、80、90℃）作为变量，液料比30:1，提取时间180min，提取1次，研究提取温度对多糖提取率的影响。

（2）提取时间对多糖提取率的影响

选择不同的时间（60、90、120、150、180min） 作为变量，液料比30:1，提取温度70℃，提取 1次，研究提取时间对多糖提取率的影响。

（3）液料比对多糖提取率的影响

选择不同的液料比（10:1、20:1、30:1、40:1、50:1）作为变量，提取时间180min，提取温度70℃，提取 1次，研究液料比对多糖提取率的影响。

2.2.2 多糖提取率的计算

式中，质量的单位均为g。

2.3 多糖抗氧化活性的测定

2.3.1 还原力

在试管中加入一定体积0.1mg/mL的样品，用磷酸盐缓冲溶液（0.2mol/L、pH 6.6）定容到 2.5mL，加质量分数为1%的铁氰化钾溶液5mL，随后将试管放入50℃水浴锅中加热20min，反应后取出试管，随即加入10%的三氯乙酸溶液5mL，将试液充分摇匀后静置5min。取上清液2.5mL，添加2.5mL的蒸馏水和0.5mL1%的氯化铁溶液。将摇匀后得到的试液置于700nm条件下测定吸光度值。同时采用相同体积质量分数为0.1mg/mL的BHT为阳性对照。

2.3.2 对Fe2+离子螯合能力

加入一定体积的浓度为0.1mg/mL样品于试管中，然后依次添加2mol/L的氯化铁溶液0.1mL，5mmol/L的Ferrozine溶液0.2mL，充分摇匀，之后加入蒸馏水定容到5mL，于室温放置20min，在560nm波长下测定吸光度，根据吸光度计算螯合率。该试验中的阳性对照是0.1mg/mL的EDTA。

2.3.3 对DPPH自由基的清除能力

在试管中添加少量的样品，浓度为0.1mg/mL，然后添加6.5×10-5mol/L DPPH 2.5mL，充分摇匀后，用70%的乙醇溶液定容到4mL，再次摇匀，在避光处放置20min，之后将溶液摇匀，避光20min后在500nm测量吸光度，并由此计算自由基的清除率。在该试验中的对照样品是0.1mg/mL的BHT。

2.3.4 对羟基自由基的清除能力

取两个干净的试管，并标号1、2。两个试管中分别加入少量的0.1mg/mL的样品，然后分别再加入9mmol/L的四氯化铁EDTA溶液1mL，在1号试管中再加入9mmol/L的水杨酸乙醇溶液1mL，2号试管不加，然后将浓度为8.8mmol/L过氧化氢溶液1mL加入试管中，并将1、2号试管用蒸馏水定容到5mL。充分将两个试管摇匀后，于500nm下测定吸光度，计算出清除率，判断清除羟基自由基的能力。本次试验用等体积的抗坏血酸作为对照组。

3 结果与分析

3.1 双孢菇多糖提取的优化试验

3.1.1 多糖提取的单因素试验

（1）提取温度对多糖提取率的影响

图1 不同提取温度下的多糖提取率Fig.1 Extraction rate of polysaccharide with different temperature

从图1可知，温度在50～70℃之间时，双孢菇多糖的提取率随着温度的升高逐渐增加，但温度超过70℃以后，多糖的提取率呈现略下降趋势。因此，选择70℃为双孢菇多糖提取的最佳温度。

（2）提取时间对多糖提取率的影响

从图2可知，提取时间为60～120min时，双孢菇多糖的提取率随着时间延长存在明显的上升趋势（P＜0.05）。当提取时间达到120min以上时，双孢菇多糖提取率上升非常缓慢（P＞0.05）。因此，120min为提取双孢菇多糖的最佳温度。

图2 不同提取时间下的多糖提取率Fig.2 Extraction rate of polysaccharide with different time

（3）液料比对多糖提取率的影响

由图3可见，多糖的提取率随着液料比的增加呈现先增加后下降的趋势，在液料比为30:1时的多糖提取率较20:1时显著增加（P＜0.05），随着液料比的持续增加，多糖提取率并未有显著上升（P＞0.05）。因此，30:1时为提取双孢菇多糖的最佳液料比。

图3 不同液料比下的多糖提取率Fig.3 Extraction rate of polysaccharide with different ratio of liquid to material

3.1.2 双孢菇多糖提取的正交试验

在单因素的基础上，选取对结果影响显著的单因素设计正交试验，试验设计见表1，结果见表2。

表1 双孢菇多糖提取正交试验设计Table 1 Orthogonal test design of polysaccharide extraction fromAgaricus bisporus

表2 双孢菇多糖提取正交试验结果Table 2 Orthogonal test result of polysaccharide from Agaricus bisporus

从表2可以看出，RC＞RA＞RB，所以各因素对多糖提取率影响由大到小依次为：液料比＞提取温度＞提取时间。多糖最佳提取方案为A3B2C3，即提取温度为80℃，提取时间为120min，液料比为40:1。经验证最优方案多糖提取率为1.53%，均优于其他试验组。

3.2 多糖抗氧化活性分析

3.2.1 多糖的还原力

物质还原力的大小和抗氧化活性有一定关系，因此，可通过测定还原力的大小来判断物质抗氧化性的高低[10]。由图4可以看出，双孢菇多糖的还原力与BHT的还原能力相当（P＞0.05），可见，双孢菇多糖具有很好的还原力，并在一定的范围内与浓度呈正比。

图4 双孢菇多糖的还原力Fig.4 Reducing capacity of polysaccharides from Agaricus bisporus

3.2.2 多糖对Fe2+的螯合能力

生物体内·OH可由H2O2与金属离子反应产生，两者具有相同的作用趋势，推测多糖能够通过螯合金属离子（如Fe2+等）来降低机体产生·OH的速度，两者的存在是呈正比关系，螯合力大的抗氧化剂，抗氧化性也较强[11]。图5表明，双孢菇多糖的螯合能力一直高于EDTA，在溶液浓度为0.4mg/mL之前，差异显著（P＜0.05），随着浓度的增加，两者的螯合能力差异变小（P＞0.05）。

图5 双孢菇多糖对Fe2+的螯合能力Fig.5 The chelation ability of polysaccharides with Fe2+fromAgaricus bisporus

3.2.3 多糖对DPPH自由基的清除能力

由图6可见，双孢菇多糖对DPPH自由基的清除能力稍高于BHT，二者变化趋势大致相近，这表明双孢菇多糖对DPPH自由基的清除能力较强。

图6 双孢菇多糖对DPPH自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability on DPPH free radicals of polysaccharides fromAgaricus bisporus

3.2.4 双孢菇多糖对羟基自由基的清除作用

由图7可见，双孢菇多糖的清除羟基自由基的能力明显要比VC强（P＜0.05），随着浓度的增加，清除率趋于平缓，接近最大值80%左右。

图7 双孢菇多糖对羟基自由基的清除作用Fig.7 Scavenging ability on Hydroxyl radical of polysaccharides fromAgaricus bisporus

4 结论

本试验采用新鲜双孢菇作为材料，优化双孢菇多糖的提取工艺参数为：提取温度80℃，提取时间120min，液料比40:1，在此条件下双孢菇多糖的提取率可达1.53%，烘干后双孢菇多糖含量可达10.2%。双孢菇的含水率约在90%左右，提取率与松乳菇多糖的提取[12]、海鲜菇多糖的提取[13]等的结果相近。

双孢菇多糖对金属离子具有较强的螯合能力和还原力，它能够清除羟基自由基和DPPH自由基，是一种纯天然的抗氧化剂，可以应用于多种领域，具有很好的发展潜力，开发前景非常广阔。

参考文献：

[1]熊泽,邵伟,黄艺.双孢磨菇多糖提取工艺优化研究 [J].三峡大学学报:自然科学版,2007,29(4):367-340.

[2]危贵茂,付桂荣,袁诚,等.菌类食品的功能特性及开发前景[J].食品研究与开发,2006,27(2):94-95,98.

[3]韦保耀,余小影,黄丽,等.双孢蘑菇多糖抗菌活性及对食品腐败抑制的研究[J].食品科技,2007,(4):93-95.

[4]李万德,何利华,施金山.对发展双孢蘑菇产业的几点思考[J].湖北生态工程职业技术学院学报,2008,6(2):14-16.

[5]班立桐,吴疆,杨红澎.双孢菇中活性成分与保鲜技术的研究进展[J].食品研究与开发,2010,31(4):185-186.

[6]王鸿磊,王红艳,丁强,等.响应面法优化双孢菇菇柄多糖的提取工艺研究[J].北方园艺,2010,(22):163-166.

[7]乔德亮,陈乃富,张莉,等.双孢蘑菇子实体多糖提取条件优化及部分特性研究 [J].食品与发酵工业,2011,37(2):195-199.

[8]李明元.真菌粗多糖测定方法的研究 [J].食品研究与开发,2007,28(5):118-120.

[9]吴素玲,孙晓明,王波,等.双孢蘑菇子实体营养成分分析[J].中国野生植物资源,2006,25(2):52.

[10]刘科梅,聂挺,潘栋梁,等.量子化学计算研究4种黄酮类天然抗氧化物清除自由基活性的构效关系[J].南昌大学学报（理科版）,2016,40(3):250-256.

[11]徐静珠,吴彩娥,应瑞峰,等.青钱柳叶多糖不同组分体外降血糖及抗氧化活性研究[J].南京林业大学学报（自然科学版）,2017,41(4):6-12.

[12]应瑞峰，黄梅桂，王耀松，等.超声波微波协同提取青钱柳超微粉多糖及活性研究[J].食品研究与开发,2017,38(23):32-37.

[13]廖国会,龙家寰,秦立新,等.松乳菇多糖提取工艺优化及抗氧化活性评价[J].食品工业科技,2018,39(4):123-130.

[14]李淑荣,王丽,唐选民,等.响应面法优化海鲜菇中多糖提取工艺[J].食品工业科技,2018,39(1):172-176.