一株有机磷农药降解菌的筛选

一、材料与方法

（一）试验材料

1.药品。40%辛硫磷乳油，江苏宝灵化工股份有限公司生产。

2. 供试土壤。供试土壤采自景泰、陇西及兰州市安宁区长期施用辛硫磷的蔬菜地。

3.仪器设备。恒温振荡摇床，超净工作台，高压湿热灭菌锅，人工气候箱，紫外可见分光光度计。

4.培养基。一是基础盐培养基：MgSO4·7 h2O 0.5 g；K2PHO4·3 h2O 1.31 g；FeSO4·7 h2O 0.018 g；NaNO33.0 g；KCl 0.5 g；H2O 1000 mL；121 ℃，0.1 mPa蒸汽灭菌30 min。二是以辛硫磷为唯一碳源的培养基：MgSO4·7 h2O 0.5 g；K2PHO4·3 h2O 1.31 g；FeSO4·7 h2O 0.018 g；NaNO33.0 g；KCl 0.5 g；辛硫磷100～600 mmol；H2O 1000 mL；121 ℃，0.1 mPa蒸汽灭菌30 min。三是LB培养基：胰蛋白胨10.0 g；酵母粉5.0 g；NaCl 10.0 g；H2O 1000 mL；121 ℃，0.1 mPa蒸汽灭菌30 min。

（二）试验方法

1.土壤中降解菌的驯化。菌种的驯化方式采用逐渐加量的驯化方式。取土样10 g，将土样加入辛硫磷质量分数为100 mmol/L的100 mL基础盐培养基中，在温度28 ℃、转速为120 r/min的条件下振荡培养7 d，然后取10 mL培养液接入100 mL新鲜基础盐培养基（培养基中辛硫磷浓度每一周期逐步提高，浓度依次为200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L），振荡培养7 d，连续驯化富集4次。

2.菌种的分离和纯化。每一驯化周期，均取培养液稀释涂布于上述培养基平板上，28 ℃恒温培养48 h，待长出菌落后，挑取生长速度较快，菌落大而形态不一的菌落进一步分离，挑选典型的单菌落，反复纯化，直到菌落表面颜色、质地等形态特征完全一致，保存。

3.菌株生长曲线的测定。取适量的纯化菌株S1分别接入50 mL LB培养基和辛硫磷质量分数为50 mL（300 mmol/L）的基础盐培养基中，预培养到对数生长期（OD600达到0.6），将在LB中预培养的菌液按2%的接入量分别接入50 mL LB和辛硫磷质量分数为50 mL（300 mmol/L）的基础培养基中，将含辛硫磷（300 mmol/L）的基础培养基中预培养的菌液按2%的接入量接入辛硫磷质量分数为50 mL（300 mmol/L）的基础培养基中，28 ℃、120 r/min摇床培养，间隔8 h取样，用紫外分光光度计测定菌体在波长600 nm处的吸光值，绘制生长曲线。

4.降解菌在不同初始农药浓度下的生长比较。选择分离纯化后生长良好的菌株S1接种于以辛硫磷为唯一碳源的基础盐培养基中，辛硫磷设置100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L 、500 mmol/L、600 mmol/L 6个不同浓度梯度，每处理3次重复。在28 ℃的恒温箱中培养72 h后，使用紫外分光光度计测定菌体在波长600nm处的吸光值，然后进行比较。取只加农药不接降解菌的基础盐培养基的吸光值校为零。

二、结果与分析

（一）降解菌的生长曲线测定结果

生长曲线测定结果如图1所示，在LB培养基中预培养到对数生长期（OD600达到0.6）再以2%的接种量接种到50 mL LB培养基中的菌株，菌株生长迟缓期只有4 h，然后菌株迅速进入对数生长期。培养20 h菌株进入生长稳定期，到24 h就达到最大生长量，菌株的浓度不再增加。

在辛硫磷培养基中预培养再以2%的接种量接种到辛硫磷培养基的菌株，菌株生长迟缓期有8 h，然后菌株进入对数生长期，对数生长期持续时间达32 h，培养40 h进入稳定期，到48 h达最大生长量，菌株的浓度不再增加。

（二）降解菌在不同初始农药浓度下的生长比较

由图2可知，菌株S1在辛硫磷浓度分别为100 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L、500 mmol/L、600 mmol/L的基础盐培养基中的OD600nm吸光值值明显小于辛硫磷浓度300 mmol/L的基础盐培养基中的OD600nm吸光值。菌株S1降解辛硫磷的效率在辛硫磷浓度为300 mmol/L效率最高。低农药浓度下菌株S1生长较弱，由于碳源不足，抑制菌株生长，从而抑制了其对辛硫磷的降解。随着初始农药浓度增加，菌体生长渐好，辛硫磷浓度为300 mmol/L时吸光值达到最大值，农药降解效果最好。辛硫磷浓度持续增加时，菌株S1生长放缓，农药浓度过高对菌株有毒害作用，抑制菌株生长，导致菌株对辛硫磷的降解降低。

（三）降解菌在不同温度下的生长比较

由图3可知，温度对菌株S1的生长影响非常显著，在25 ℃时，菌株OD600nm吸光值最大，菌株生长最好，随着温度的升高，其生长明显受到抑制。由此可以推测，菌株S1的在中低温时降解效果较好。甘肃省气温日差较大，年平均气温在0～14 ℃，而菌株S1在中低温中生长较好，说明菌株S1能在该省大部分地区的土壤中生长。

三、结论

从试验可以看出，温度及初始农药浓度对菌株的生长都有一定影响。至于初始pH值、接种量等对菌株的生长影响尚需研究。菌株S1在辛硫磷初始浓度为300 mmol/L的基础盐培养基中，28 ℃、120r/min摇床培养40 h，对辛硫磷的降解率初步测定达到56.45%，说明菌株S1能降解辛硫磷，菌株S1作为辛硫磷降解菌有进一步优化培养并应用于治理河南省有机磷农药污染等方面的潜力。

图1 菌株S1生长曲线图

图2 初始农药浓度对菌株S1的生长影响

图3 温度对苗株S1的生长影响