中华绒螯蟹乙酰胆碱酯酶免疫调节作用的初步研究

石小倩 高洁 张海娟 赵志龙 董芳 修婷 魏英焕 史晓委

【摘 要】目的：分析中华绒螯蟹乙酰胆碱酯酶的免疫调节作用。方法：利用LPS和TNF-α 作为免疫激活因子，刺激中华绒螯蟹的免疫系统，然后检测被激活的免疫系统对中华绒螯蟹乙酰胆碱酯酶的表达水平和酶活力的影响。结果：LPS和TNF-α 可显著提高中华绒螯蟹血淋巴细胞中AChE基因的表达水平和血淋巴上清液中ACh的浓度。结论：中华绒螯蟹乙酰胆碱酯酶在其免疫应答反应过程中发挥着重要的作用。

【关键词】中华绒螯蟹；乙酰胆碱酯酶；LPS；TNF-α

【中图分类号】R412 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2018）04-0-01

乙酰胆碱酯酶（AChE； EC 3.1.1.7）能催化分解乙酰胆碱，是胆碱能神经系统的重要组成部分。在脊椎动物中，乙酰胆碱酯酶可以通过控制血清中乙酰胆碱的浓度，来调节炎症反应[1]，而关于乙酰胆碱酯酶在无脊椎动物中的免疫调节研究相对较少。目前，已有研究表明乙酰胆碱酯酶广泛存在于无脊椎动物胆碱能神经系统中，且在扇贝等软体动物中发挥着重要的免疫调节作用[2]。本研究拟利用LPS和TNF-α 刺激中华绒螯蟹，检测中华绒螯蟹血淋巴中乙酰胆碱酯酶基因的时序表达变化规律及血淋巴中乙酰胆碱浓度的时序变化，本研究可进一步丰富无脊椎动物胆碱能神经免疫的内容。

1 仪器和试剂

高压灭菌锅（上海申安）、超低温冰箱（中科美菱）、高速冷冻离心机（艾本德）、温度梯度PCR仪（艾本德）、实时荧光定量PCR仪（罗氏LC96）、酶标仪（伯腾）、脂多糖LPS（Sigma，0.5 mg/mL）、肿瘤坏死因子-α（Sigma，乙酰胆碱检测试剂盒（Abnova）、RNA提取试剂盒（Invitrogen）、dNTP（Promega）、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（寶生物）等。

2 实验方法

2.1 LPS免疫刺激实验 于五月份准备280重量平均为 50 ± 5 g 的中华绒螯蟹，随机选取120只作为 LPS 刺激组，另取 120 只作为对照组，剩余 40 只作为空白组，分别作如下处理：

LPS 刺激组：每只注射 50 μL LPS（0.5 mg/ml，in PBS）

对照组：每只注射灭菌 50 μL PBS

空白组：不做任何处理

注射后的 LPS 刺激组和对照组中的中华绒螯蟹立即放回养殖桶，同时随机取样 15 只空白组中的中华绒螯蟹。在注射后 3、6、12、24、48 和 96 小时，分别在 LPS 刺激组和对照组中随机取样15只中华绒螯蟹。从取样的中华绒螯蟹中抽取血淋巴，并将三只中华绒螯蟹的血淋巴混在一起，作为一份样品。800 g 4 °C 离心血淋巴 10 min，留血淋巴细胞用于提取总 RNA，留血淋巴上清液用于检测乙酰胆碱浓度变化。

2.2 TNF-α免疫刺激实验 2.10栉孔扇贝的 TNF-α 刺激实验。于五月份准备 280 只平均重量为 50 ± 5 g 的中华绒螯蟹，随机选取120只作为 TNF-α 刺激组，另取 120 只作为对照组，剩余 40 只作为空白组，分别作如下处理：

TNF-α 刺激组：每只注射 50 μL TNF-α（50 ng/mL，in PBS）

对照组：每只注射灭菌 50 μL PBS

空白组：不做任何处理

注射后的 TNF-α 刺激组和对照组中的中华绒螯蟹立即放回养殖桶，同时随机取样 15 只空白组中的中华绒螯蟹。在注射后 3、6、12、24、48 和 96 小时，分别在TNF-α 刺激组和对照组中随机取样15只中华绒螯蟹。从取样的中华绒螯蟹中抽取血淋巴，并将三只中华绒螯蟹的血淋巴混在一起，作为一份样品。800 g 4 °C 离心血淋巴 10 min，留血淋巴细胞用于提取总 RNA，留血淋巴上清液用于检测乙酰胆碱浓度变化。

2.3 中华绒螯蟹血淋巴中 ACh 的浓度测定 ACh 测定采用 Abnova 公司生产的 ACh 试剂盒（KA1624）。乙酰胆碱可以 被乙酰胆碱酯酶催化为胆碱和乙酸，胆碱在胆碱氧化酶的催化下生成甜菜碱和过氧化氢，过氧化氢能与一种特殊的染料形成粉红色产物。这种粉红色产物在 570 nm 下的光密度值，跟乙酰胆碱的浓度成正比。

2.4 中华绒螯蟹总 RNA 的提取 无菌条件下采集中华绒螯蟹血淋巴样品，于 800 g 4 °C离心 10 min 后收集血淋巴细胞，加入 1 mL RNAiso plus，迅速用 5 mL 注射器快速吸打破坏血淋巴细胞；然后每 1 mL RNAiso plus 加入 0.2 mL 预冷氯仿，用力振荡 2 min，12，000 g 4℃离心 15 min；离心后，混合物分为上层 RNA 无色水相，中间变性蛋白层和下层淡红色有机相；将上层 RNA 无色水相移至 1.5 mL 离心管中，加入等体积异丙醇放置于-80 °C超低温冰箱中 10 min，12，000 g 4 °C离心 15 min以沉淀RNA；然后加1 mL 75% 的乙醇洗涤两次。将RNA置于4°C冰箱中 沉淀干燥 5-10 min，加入 20 μL DEPC 处理水溶解；将 RNA 样品稀释 100 倍，在紫外分光光度计下测定 OD260 及 OD280，合格的 RNA 的 A260：A280 应介于 1.8-2.2 之间。

3 实验结果

3.1 LPS对中华绒螯蟹血淋巴细胞中乙酰胆碱酯酶时序表达变化的影响

LPS 刺激中华绒螯蟹 3、6、12、24、48 和 96 小时后，中华绒螯蟹血淋巴细胞中 AChE mRNA 表达水平的显著上升，而对照组中该基因的表达水平未检测到显著变化。AChE mRNA 的表达水平在 LPS 刺激 24 小时显著高于空白组和对照组中的表达水平（P < 0.05），为空白组的 7.4 倍（图 3.1）。

3.2 TNF-α 对中华绒螯蟹血淋巴液中乙酰胆碱酯酶时序表达变化的影响

为了进一步验证中华绒螯蟹胆碱能信号通路响应免疫应答的机制，利用人 TNF-α（50.0 ng/mL）刺激中华绒螯蟹 3、6、12、24、48 和 96 小时后，中华绒螯蟹血淋巴细胞中 AChE mRNA 基因的表达水平呈先上升后下降的趋势。在 TNF-α 处理 3 h、6h、12h 小时后，AChE 基因的表达水平分别是对照组的 2.2 倍（P < 0.05）、3.4 倍（P < 0.05）和 1.9 倍（P < 0.05），其中 TNF-α 刺激6 小时处，AChE 基因的表达水平达到最高值（图 3.2）。

3.3 免疫刺激对中华绒螯蟹血淋巴液中乙酰胆碱浓度变化的影响

用 LPS 和 TNF-α 刺激中华绒螯蟹 3、6、12、24、48 和 96 小时后，采用比色法检测中华绒螯蟹血淋巴中乙酰胆碱浓度的时序变化。中华绒螯蟹血淋巴中去乙酰胆碱浓度在LPS刺激 6 h 处达到最高值（12.36 ×10-6 M，P < 0.05）；在 其它时间点，乙酰胆碱浓度与对照组相比没有显著性差异（图 3.3）。中华绒螯蟹血淋巴中的乙酰胆碱浓度在 TNF-α 刺激 3 h 后即达到最高值（13.51×10-6 M，P < 0.05），显著高于对照组，6 h 后，乙酰胆碱浓度开始下降，但仍显著高于对照组水平（12.56×10-6 M，P < 0.05），在 12-96 h 乙酰胆碱浓度与对照组相比没有显著差异（图 3.3）。相比 LPS 刺激，中华绒螯蟹血淋巴中乙酰胆碱浓度对 TNF-α 刺激的响应更敏感。以上结果表明，LPS 和 TNF-α 刺激显著诱导了中华绒螯蟹血淋巴中乙酰胆碱浓度的上升，并且 TNF-α 刺激比 LPS 刺激效果更顯著。

4 讨论与结论

已有研究表明，AChE在高等动物免疫调节过程中发挥着重要的作用，在低等无脊椎动物中，也有关于AChE参与免疫应答反应的相关报道[3]。本研究在中华绒螯蟹免疫应答反应过程中，免疫刺激因子 LPS 和 TNF-α 均可激活中华绒螯蟹的胆碱能神经系统，提高中华绒螯蟹血淋巴细胞中 AChE 基因的表达水平，以及提高血淋巴上清液中 ACh 浓度的变化。中华绒螯蟹被激活的胆碱能神经系统，将反馈调节其免疫应答反应，促使机体重新恢复内稳态。因此，中华绒螯蟹的胆碱能神经系统在其免疫调节过程中发挥着重要作用。

参考文献

Jiang，Y.Y.，et al.，[Acetylcholine suppresses microglial inflammatory response in rats via acting on microglial alpha7nAChR].Sheng Li Xue Bao，2018.70（1）：p.33-39.

Shi，X.，et al.，Acetylcholine modulates the immune response in Zhikong scallop Chlamys farreri.Fish Shellfish Immunol，2014.38（1）：p.204-10.

Silva，A.D.，et al.，Chagas disease：modulation of the inflammatory response by acetylcholinesterase in hematological cells and brain tissue.Mol Cell Biochem，2018.438（1-2）：p.59-65.