海洋藻类藻胆蛋白的提取、纯化与应用研究进展

于 娇,胡 晓,杨贤庆,陈胜军,*

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,国家水产品加工技术研发中心, 农业部水产品加工重点实验室,广东广州 510300; 2.上海海洋大学食品学院,上海 201306)

我国海洋藻类资源丰富,海水养殖面积达140千公顷,年产量高达217万t[1],具有巨大的碳汇潜力[2]和经济开发价值。迄今,虽然部分海藻已实现工业化培育、养殖和采收,但海洋藻类仍旧作为初级产品进入销售市场,高新技术利用不足,精深加工产品较少,海洋藻类经济效益有待提升。藻胆蛋白(phycobiliprotein,PBP),作为一种具有良好生理功能和生物活性的海藻提取物,主要存在于红藻、蓝藻、隐藻和一些甲藻中,可根据光谱特性的差异分为藻红蛋白(phycoerythrin,PE)、藻蓝蛋白(phyeocyanin,PC)、别藻蓝蛋白(allphycocyanin,APC)和藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin,PEC)。其中PE可根据其光谱特性的细微差异分为R-PE、C-PE、B-PE,而PC又可分为R-PC和C-PC[3],简称前分别冠以C-、B-、R-,这些字母用于表示不同的吸收光谱特性[4]。PBP因具有良好的生理功能和生物活性而用途广泛,其良好的荧光特性被广泛应用于临床医学、免疫学和细胞学等应用领域,其光敏特性可作为光敏剂应用于医疗领域,其作为一种纯天然、无公害的色素还可应用于食品、化妆品和染料等工业领域,其抗氧化、抗炎症和抗肿瘤等生物活性可作为保健成分应用于保健食品和药品行业领域。

PBP因具有良好的光学特性,其纯度一般采用最大可见吸收峰波长处的吸光值与280 nm处的吸光值之比(Aλmax/A280)来表示。为了获取高纯度、高活性的PBP,国内外研究者们集中于破壁方法和分离纯化技术做了大量的工作。而PBP产品多是来自于纯天然海洋生物提取,工业生产时常遇到来源于产品得率、产品纯度和生产成本的挑战,因此市场上的PBP产品通常价格高昂,这就限制了其加工生产和推广利用。为了达到高纯度、低成本的商品化生产要求,PBP的提取与分离纯化主要集中于合理搭配多种技术、缩减操作流程以及规模化生产。本文主要对PBP的分离纯化和应用研究予以概述,以期为促进海藻的开发和精深加工提供重要参考。

1 藻胆蛋白的提取

目前,国内外提取PC的原料多为螺旋藻,而PE的提取原料多为龙须菜和紫菜。作为一种优质的胞内蛋白,提取PBP的首要步骤是破碎藻体组织细胞壁。随着生物技术产业的迅猛发展,新型破壁方法如液氮研磨法、酶法、超声辅助提取法、微波辅助提取法和多针-板电晕放电技术提取法等被应用到PBP的提取过程中,与传统破壁方法相比,具有纯度高、成本低、稳定性和延展性好等优势。

1.1 传统提取方法

传统提取方法如水溶液提取法、组织破碎法和反复冻融法,存在着产品耗时长、易变性、效率低和能耗高等缺点,不利于PBP的推广和使用。水溶液提取法耗时长、效率低,不适合规模化生产,而且溶液杂质的残留可能会影响后期的分离纯化。赵丽等[5]采用水溶液提取法破碎红藻藻体组织细胞壁提取R-PE,提取时长120 h,纯度才达到0.38。组织破碎法操作简单、省时,但机械破碎时间过长易致使蛋白质变性,需做好降温措施。郑江等[6]采用组织破碎法破碎红毛藻组织细胞,10 min后测得上清液中的PE纯度为0.30。反复冻融法是通过-20 ℃下冷冻,5 ℃下融解后引起冰粒的形成和盐浓度的增加破碎藻体细胞,促进蛋白的溶出以实现PBP的提取富集。反复冻融法虽操作简单,但其耗时长,能耗高,应用成本较高,只适合实验室小规模生产。郑蔚然[7]等采用反复冻融法提取R-PE,冻融6次,每次冻融3 h,R-PE的纯度为0.42。

1.2 新型提取方法

1.2.1 液氮研磨法 液氮的温度为-196 ℃,它不仅能使藻体组织的硬度、脆性增加,易于研磨,还能保护组织成分不被破坏和降解。通常,先用液氮处理藻体使组织细胞被完全冻结,再将组织研磨成粉,置于缓冲溶液中解冻,最后高速离心浓缩粗提液[8]。Soni等[8]采用液氮冷冻藻体,研磨至粉末状,再置于Tris-HCl缓冲液中解冻,提取的C-PC纯度达0.42。与传统破壁方法相比,液氮研磨法不仅能够有效维持蛋白质的活性,还具有操作简单、成本低、重复性和延展性好的优势[9],可用于规模化破碎藻体组织细胞。丙潇潇等[10]向瓷研钵中的红藻坛紫菜粉加入液氮,反复研磨15 min,并溶于0.01 mol/L磷酸盐缓冲液中,离心后测得粗提液中的R-PE的纯度为0.38。

1.2.2 酶辅助提取法 海藻细胞壁的主要成分是具有多糖类结构的纤维素,可利用纤维素酶或果胶酶水解海藻细胞壁,减少了细胞壁和细胞间质的传质阻力,有利于PBP高效的流出。赵丽等[5]用纤维素酶提取的R-PE,处理时长15 h,纯度可达0.37。与传统的碱提法相比,酶法反应条件温和,而且不易引入杂质,且能更好的维持蛋白质的构型、构象和光学特性。施瑛等[11]比较了纤维素酶、果胶酶对紫菜PE的提取效果,研究发现纤维素酶和果胶酶的最佳酶配比为7∶3的复合酶液提取效果更好,得率可达2.26%,纯度可达1.66。复合酶比单一酶在藻体组织细胞壁降解效果上更有优势,为PBP的规模化生产提供了新思路。

1.2.3 超声波辅助提取法 该法是利用超声波产生的空穴、热和机械效应破碎藻体组织细胞壁,促使细胞内的PBP充分溶解出来。超声波辅助提取法一般不单独使用,仅作为细胞破壁的辅助手段,通常与水溶液提取法联合使用。丙潇潇等[10]采用超声波法破碎法提取红藻中的R-PE,处理时长20 min,其纯度可达0.51。与传统方法相比,超声波辅助提取法引入的杂质少,耗时短,效率高,但超声过程中会产生较多热量,因此需要及时降温,以免藻胆蛋白变性。Benavides等[12]采用超声辅助提取紫球藻中的B-PE,研究发现其提取率是水提法的5倍。为了获得理想的溶解促进和传质强化的效果,少数研究者采用交替双频逆流超声技术提取蛋白质。交替双频逆流超声技术综合了交替双频超声技术与逆流提取技术的优势,既有交替双频超声模式的促溶效果好、节能环保的优点,又有逆流超声技术提取效率高、能量均一的好处。曲文娟等[13]采用交替双频逆流超声辅助提取条斑紫菜蛋白质,获得的蛋白得率为24.35%,明显高于传统提取方法的蛋白得率7.19%。交替双频逆流超声辅助提取方法较水溶液提取法在生产成本上具有显著的技术优势和推广价值。

1.2.4 微波辅助提取法 微波辅助提取(microwave-assisted extraction,MAE)是一种新型的蛋白质提取技术,比常规提取方法在纯度和提取时间上具有显著的技术优势[14]。为了防止处理时间过长或温度过高导致蛋白质失活,需要控制好处理暴露持续时间和处理温度。Juin[15]首次采用微波辅助提取紫球藻中的PE,研究发现40 ℃时PE具有热稳定性,并于微波照射10 s后获得PE的纯度最高可达2.2。考虑到产品纯度、延展性和生产成本,微波辅助提取法是一种非常高效的提取方法。

1.2.5 多针-板电晕放电提取法 多针-板电晕放电提取法是一种新型的藻体组织细胞壁破壁提取方法,通过多余的负离子与正离子中和放出的巨大的能量使得藻体细胞壁产生0.4～40 μm大小不等的空洞,从而使藻胆蛋白从空洞溶出,并且等离子体温度较低,不会导致热量过高引起蛋白质变性。与常规提取方法相比,具有操作简单、效率高、耗时短、成本低、环保无污染的技术优势,多针-板电晕放电提取法是一种非常高效的提取方法。赵丽等[5]采用多针-板电晕放电提取红藻中的R-PE,并通过与溶胀法、反复冻融法和CaCl2破碎法相比较,研究发现仅用3 min就能够达到最好的破碎效果,获得的R-PE纯度可达0.47,而且整个过程不需要添加任何化学试剂,不需要提取预冷,可在室温下处理。以PE为例,根据以上文献总结不同提取方法的优缺点,见表1。

表1 PE的不同提取方法的优缺点Table 1 Advantages and disadvantages of different extraction methods of phycoerythrin

1.3 联合法

新型提取方法还可与传统提取方法组合使用,优势互补,进而实现高提取率粗提液的规模化生产。目前,常见的组合方式有酶法与水溶液提取法、超声波辅助提取法与反复冻融法等。段杉等[16]研究发现纤维素酶结合水溶液提取法比水溶液提取法在蛋白质提取率上具有更大的优势。白露等[17]采用超声波辅助提取法与反复冻融法结合提取坛紫菜蛋白质,表明组合法比单一法在提取得率和含量上效果更优。

2 藻胆蛋白的分离纯化

粗提液中PBP纯度低、杂质多,需要分离和纯化以除去杂蛋白、多糖和其他成分,从而提高PBP纯度。国际上PBP产品的纯度可划分为四种级别:食品级(Aλmax/A280>0.7)、药品级(Aλmax/A280>3.0)、反应级(Aλmax/A280>3.9)和试剂级(Aλmax/A280>4.0)。蛋白质纯化的关键是根据实验目的选择合适的纯化技术,并可多种纯化技术组合使用,以缩减操作流程、提高纯度和降低成本。新型分离纯化方法有利凡诺沉淀法、壳聚糖吸附沉淀法、活性碳吸附沉淀法和双水相萃取法等。

2.1 传统的分离纯化方法

随着人们对PBP的研究逐渐深入以及各种分离纯化技术的不断出现,对于其分离提纯的方法也越来越多。PBP的传统分离纯化方法主要有凝胶层析法、离子交换层析法、羟基磷灰石柱层析法、等电点沉淀法、盐析法和超滤法。凝胶层析是最简单和最温和的层析技术,可用于藻胆蛋白的脱盐、分离提纯和浓缩,但其生产规模小,成本较高。Reisf等[18]利用Sephacryl S-100 HR凝胶纯化PE,使其纯度从0.8提高到3.5。而离子交换层析是最常用的层析方法,具有纯化效果好,分析速度快等优点,但其离子交换层析介质成本较高,这就限制了其工业推广使用。冯亚非等[19]采用一步羟基磷灰石柱层析法,利用磷酸缓冲液梯度洗脱,后经冷冻干燥,得到药品级标准的PE。等电点沉淀法应用于工业化生产时,不仅易于扩展,也不需要复杂的操作步骤。目前,常用的等电点沉淀介质是冰醋酸,Zhu等[20]采用冰醋酸作为等电点沉淀介质沉淀PBP,冰醋酸溶液易挥发分离,简化了生产工艺。硫酸铵沉淀法是最常用的蛋白质沉淀方法,操作简便,但其最大缺点是耗时长、蛋白质易变性。Sorensen等[21]采用一步、二步硫酸铵沉淀提取C-PC,C-PC的纯度提高到0.7和1.1。超滤是一种膜分离技术,不仅能净化粗提液,浓缩PBP,还可维持其结构特性和光学特性,具有耗时短、产量高和纯度高的优点。

2.2 新型的分离纯化方法

2.2.1 利凡诺沉淀法 利凡诺沉淀法是一种用于蛋白质的分离纯化的新型简化方法,通过与蛋白质形成复合物使得蛋白质与其他粗提物分离开来。利凡诺试剂可用于沉淀和消除藻类多糖等杂质,还可使用硫酸铵沉淀使目标蛋白与杂蛋白差异分离,可获得较高纯度的目标蛋白[22]。与传统层析法相比,该法避免了透析步骤,简化了分离纯化步骤,具有简便、成本低和可扩展性等优点。但试剂的介入带入了杂质,可通过进一步的凝胶过滤结合除去杂质。Minkova等[23]采用利凡诺试剂对细胞提取液四步沉淀处理,上清液中C-PC纯度增加至3.9。这种技术为PBP的分离纯化提供了新思路,但该技术仍需发展成熟才能投入到工业化生产中去。

2.2.2 壳聚糖和活性炭吸附沉淀法 壳聚糖对带负电荷的蛋白质具有吸附沉淀的作用,因而可通过调节pH使得杂蛋白被吸附沉淀,从而实现目的蛋白的分离纯化。壳聚糖吸附沉淀法不仅能避免繁杂的层析纯化步骤,还具有效率高、成本低、产量高和延展性好的优势[3]。而活性炭是一种低成本且接触面积大的疏水性吸附剂,对疏水性蛋白质具有吸附沉淀的作用,通过吸附杂蛋白并使之沉淀实现藻胆蛋白的分离纯化。廖晓霞等[24]研究发现壳聚糖和活性炭结合使用可使PC纯度由0.93提高至2.78,与传统的盐析法相比,壳聚糖和活性炭结合使用具有耗时短、得率高、条件温和、缩减操作流程等优势。Gantar等[25]采用活性炭和壳聚糖纯化C-PC,研究发现其纯度由2.0增加到3.6。

2.2.3 双水相萃取法 与传统层析法相比较,双水相萃取法具有低溶剂、传质和分相效率高、安全环保等优势[26]。双水相萃取法通常作为初步使用,同时也需要与超滤、层析技术相结合使用,提升纯度并除去双水相萃取中的聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)和小分子杂质。但目前PEG的去除仍有难度,PEG的分子量越大,空间阻力就越大,双水相体系粘度增加直接加大了分相的难度。Sorensen等[21]采用双水相萃取法纯化提取C-PC,并采用超滤法进一步纯化,研究发现C-PC的产量高达42%,纯度高达4.5。双水相萃取法不仅可单次使用,还可多次双水相萃取以制备高纯度的藻胆蛋白。Patil等[27]利用双水相萃取法分离纯化从螺旋藻中提取的C-PC,在单次萃取中C-PC的纯度分别为3.23,多次萃取后C-PC的纯度提高到4.02。目前,聚乙二醇(PEG)/葡聚糖/水是比较常用的双水相成分,但由于聚合物的价格昂贵,难以应用到PBP规模化生产中去。因此,有待研究开发新型的相成分以促进萃取法在藻胆蛋白工业化生产中的应用。

3 藻胆蛋白的应用

3.1 天然色素

由于人工合成色素的毒性作用,人们对天然色素的需求越来越大[28],因此PBP作为天然、安全的天然色素添加剂备受食品加工业青睐[29],但其因容易受pH、温度、光照、矿质元素[30]等因素的影响而在应用上有所限制。蒋保季等[31]对天然食用色素PBP进行了大、小鼠经口LD50,骨髓微核实验,睾丸精母细胞染色体畸变分析,Ames实验以及离乳大鼠30 d喂养测定分析,发现PBP对实验动物无明显毒性作用,具有广泛的发展前景。作为一种天然色素,PBP既可取代人工合成的色素[32],还可人为调配PE、PC和APC的比例达到人工染料所不能达到的效果,当其纯度大于0.7(食品级)时,可应用于食品、化妆品和染料等工业领域。在欧美、日本等国,PBP广泛用作食品和化妆品的天然色素,并被制成康复药品和保健食品。Santos等[33]利用螺旋藻提取PC,并作为食品中的天然色素应用于口香糖、乳制品产品和果冻中。

3.2 保健食品和医药

现代研究表明,PBP有免疫调节、抗肿瘤等多种生物学功能[34],能提高人体免疫力、促进血红细胞生成、抑制癌细胞,从而在医药等行业领域有着非常广阔的应用前景,当其纯度大于3.0(药品级)可应用于保健食品和医药领域。叶翠芳等[35]研究发现PBP、多糖、类菌胞素氨基酸等紫菜提取物对紫外辐射损伤有修复作用;PR等[36]研究发现C-PC对脑缺血损伤有明显的保护作用,从而改善运动功能;Soni等[37]研究发现C-PE能够剂量反应性地降低CCl4诱发的毒性;Soni等[38]又发现了C-PE对糖尿病并发症具有修护作用。此外,PBP还具有抗氧化、抗辐射和抗炎症等功能,能有效的修复氧化损伤和辐射损伤,因此在保健食品行业具有良好的应用前景。Gupta等[39]研究发现C-PC能够有效地修复TBT诱导的氧化损伤;Patel[40]等发现PC具有良好的羟基和过氧基清除能力;Benedetti等[41]研究发现微藻中的PC具有抗炎症和抗氧化的功能。

3.3 荧光探针

PBP是一类新型的荧光探针,与传统化学荧光探针相比,具有灵敏度高、保存期长、无毒副作用、易交联、选择性和稳定性好等优势,当其纯度大于4.0(试剂级)时可应用于临床医学、免疫学和细胞学等应用领域。PBP中可用于荧光探针的有PE、PC和PEC。PE荧光特性稳定且量子产率高,是最为常用的荧光探针,而PEC因在藻体的含量极低,研究较少。

3.4 光敏剂

光敏剂于特定波长的激光照射下形成激发态,而激发态的光敏剂通过能量传递形成单态氧,然后通过相邻的生物大分子的氧化反应杀死肿瘤细胞,从而达到治疗肿瘤的目的。传统的光敏剂血卟啉在紫外波段吸收较强,而在太阳光波段吸收也容易引起较强的光敏反应,这就要求患者光敏治疗后需要避光数周,尽可能降低毒性反应[42]。PBP克服了传统光敏剂血卟啉易引发强烈的皮肤光敏毒性的弱点,在其峰吸收波长的激光辐照下引发很强的光敏反应,而在太阳光的照射下则吸收较弱,相应的光敏反应也较弱,对皮肤光敏毒性小,当其纯度大于3.0(药品级)时,可应用于到医学治疗领域,为光敏剂治疗肿瘤开启了新的思路。目前,已有诸多学者正在做PE、PC和APC作为光敏剂的研究。蔡春尔等[43]用大于120 μg·mL-1的PE介导的激光作用下处理人肝癌BEL-7402细胞,研究发现细胞存活率不到30%。李冠武等[42]研究发现Photofrin Ⅱ、PE、PC和APC在太阳光照射下的细胞存活率分别为39%、62%、86%、91%,PE、PC和APC的光敏毒性依次降低,并且均较传统血卟啉光敏剂的日光光敏毒性弱,可用于开发成新型光敏药物。

4 展望

PBP的生物活性和生理功能使其在工业、轻工业和医疗行业表现出广泛的应用前景。随着生物技术的持续发展,PBP的提取与纯化的新型工艺已成为了研究的热点和焦点。国内外学者基于高收益、高效以及安全环保的规模化生产做了大量的研究工作,新型方法与传统方法相比较具有低成本、效率高、扩展性好的优势,但其通常也具有产品易变性等缺点。如何将新型方法与传统方法相联合,取其利,避其弊,研究出最适合商品化生产的高纯度PBP的提取纯化工艺是当下要解决的关键技术问题。

迄今,诸多学者针对于PBP的生物活性做了大量工作,并通过体外实验证明其具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等多种生物功能。随着技术的飞速发展和人们保健意识的提升,PBP的制备工艺会更加成熟,应用前景将更加广泛,将促进其在工业、轻工业和医疗行业领域的开发和利用。

[1]农业部渔业渔政管理局. 2017年中国渔业统计年鉴[M]. 北京:中国农业出版社,2017:28-50.

[2]齐占会,王珺,黄洪辉,等. 广东省海水养殖贝藻类碳汇潜力评估[J]. 南方水产科学,2012,8(1):30-35.

[3]李文军. 新型藻胆蛋白的制备及其在生物传感和染料敏化太阳能电池中的应用[D]. 烟台：中国科学院烟台海岸带研究所,2017.

[4]王庭健,林凡,赵方庆,等. 藻胆蛋白及其在医学中的应用[J]. 植物生理学报,2006,42(2):303-307.

[5]赵丽. 藻胆蛋白清洁分离纯化技术研究[D]. 哈尔滨：哈尔滨工业大学,2015.

[6]郑江,高亚辉,王文星,等. 红毛藻藻红蛋白的粗提方法比较及不同光照条件下藻胆蛋白变性机制的初步探讨[J]. 厦门大学学报(自然版),2003,42(1):117-122.

[7]郑蔚然,刘书来,聂小华,等. 坛紫菜R-藻红蛋白的提取技术研究[J]. 食品科技,2008,33(11):190-193.

[8]Soni B,Trivedi U,Madamwar D. A novel method of single step hydrophobic interaction chromatography for the purification of phycocyanin from Phormidium fragile and its characterization for antioxidant property[J]. Bioresource Technology,2008,99(1):188-194.

[9]Givens R M,Mesner L D,Hamlin J L,et al. Integrity of chromatin and replicating DNA in nuclei released from fission yeast by semi-automated grinding in liquid nitrogen[J]. Bmc Research Notes,2011,4(1):499.

[10]丙潇潇,陈晨,蔡伟民,等. R-藻红蛋白的提取方法的比较研究[J]. 哈尔滨商业大学学报:自然科学版,2011,27(2):136-140.

[11]施瑛,裴斐,周玲玉,等. 响应面法优化复合酶法提取紫菜藻红蛋白工艺[J]. 食品科学,2015,36(6):51-57.

[12]Benavides J,Rito-palomares M. Simplified two-stage method to B-phycoerythrin recovery from Porphyridium cruentum[J]. Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences,2006,844(1):39-44.

[13]曲文娟,马海乐,王婷,等. 交替双频逆流超声辅助提取条斑紫菜蛋白和多糖[J]. 农业工程学报,2013,29(1):285-292.

[14]Mandal V,Mohan Y,Hemalatha S. Microwave Assisted Extraction-An Innovative and Promising Extraction Tool for Medicinal Plant Research[J]. Pharmacognosy Reviews,2007,1(1).

[15]Juin C,Ch Rouvrier J R,Thi RY V,et al. Microwave-assisted extraction of phycobiliproteins from Porphyridium purpureum[J]. Applied Biochemistry & Biotechnology,2015,175(1):1-15.

[16]段杉,朱伟珊,吴佳威,等. 利用纤维素酶辅助提取紫菜藻红蛋白的研究[J]. 水产科学,2009,28(5):280-283.

[17]白露. 坛紫菜多肽的分离纯化及其抗肿瘤活性研究[D]. 华南理工大学,2016.

[18]Reis A,Mendes A,Lobo-fernandes H,et al. Production,extraction and purification of phycobiliproteins from Nostoc sp[J].Bioresource Technology,1998,66(3):181-187.

[19]冯亚非,李先文,温燕梅,等. Method for preparing high purity phycobiliprotein with primary column chromatography[M]. 2012.

[20]Zhu J,Dong W J,Liu J. Ultrasonic Cell Disruption Followed by Isoelectric Point Precipitation for Extraction of Phycobiliprotein from Spirulina platensis[J]. Food Science,2010,31(10):146-150.

[21]Laila S R,Andrea H,Eriksen N T. Purification of the photosynthetic pigment C-phycocyanin from heterotrophic Galdieria sulphuraria[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture,2013,93(12):2933.

[22]Tcheruov A A,Minkova K M,Georgiev D I,et al. Method for B-phycoerythrin purification from Porphyridium cruentum[J].Biotechnology Techniques,1993,7(12):853-858.

[23]Minkova K M,Tchernov A A,Tchorbadjieva M I. Purification of C-phycocyanin fromSpirulina(Arthrospira)fusiformis[J]. Journal of Biotechnology,2003,102(1):55-59.

[24]廖晓霞,张学武. 高效分离纯化藻蓝蛋白新法[J]. 食品工业科技,2011(6):273-275.

[26]谷洋洋,刘冰,杜虹,等. 高纯度藻胆蛋白的分离纯化研究进展[J]. 海洋科学,2016,40(7):170-177.

[27]Patil G,Chethana S,Madhusudhan M C,et al. Fractionation and purification of the phycobiliproteins fromSpirulinaplatensis[J]. Bioresour Technol,2008,99(15):7393-7396.

[28]Ge B,Lin X,Chen Y,et al. Combinational biosynthesis of dual-functional streptavidin-phycobiliproteins for high-throughput-compatible immunoassay[J]. Process Biochemistry,2017.

[29]Sekar S,Chandramohan M. Phycobiliproteins as a commodity:trends in applied research,patents and commercialization[J]. Journal of Applied Phycology,2008,20(2):113-136.

[30]张莹,王龙乐,钟名其,等. 硼胁迫对龙须菜生长及其生理特征的影响[J]. 南方水产科学,2014,10(4):9-15.

[31]蒋保季,蒋致诚,孔祥环,等. 天然食用色素藻胆蛋白毒理学安全性评价研究[J]. 首都医科大学学报,1988(2):104-108.

[32]崔玉珍. 从海藻中提取天然食用色素的方法[J]. 精细与专用化学品,1990(4):42.

[33]Santiago-santos M C,Ponce-noyola T,Olvera-ramirez R,et al. Extraction and purification of phycocyanin from Calothrix sp[J]. Process Biochemistry,2004,39(12):2047-2052.

[34]王治. 紫菜生物活性成分研究进展[J]. 食品研究与开发,2017,38(10):215-218.

[35]叶翠芳. 紫菜提取物及其抗紫外辐射活性的研究[D]. 广东：暨南大学,2012.

[36]Pent n-rol G,Mqr n-prida J,Pardo-andreu G,et al. C-Phycocyanin is neuroprotective against global cerebral ischemia/reperfusion injury in gerbils[J]. Brain Research Bulletin,2011,86(1-2):42.

[37]Soni B,Visavadiya N P,Madamwar D. Ameliorative action of cyanobacterial phycoerythrin on CCl(4)-induced toxicity in rats[J]. Toxicology,2008,248(1):59-65.

[38]Soni B,Visavadiya N P,Madamwar D. Attenuation of diabetic complications by C-phycoerythrin in rats:antioxidant activity of C-phycoerythrin including copper-induced lipoprotein and serum oxidation[J]. British Journal of Nutrition,2009,102(1):102.

[39]Gupta M,Dwivedi U N,Khandelwal S. C-Phycocyanin:an effective protective agent against thymic atrophy by tributyltin[J].Toxicology Letters,2011,204(1):2.

[40]Patel A,Mishra S,Ghosh P K. Antioxidant potential of C-phycocyanin isolated from cyanobacterial species Lyngbya,Phormidium and Spirulina spp[J]. Indian Journal of Biochemistry & Biophysics,2006,43(1):25-31.

[41]Benedetti S,Benvenuti F,Pagliarani S,et al. Antioxidant properties of a novel phycocyanin extract from the blue-green alga Aphanizomenon flos-aquae[J]. Life Sciences,2004,75(19):2353-2362.

[42]李冠武,吴健谊,陈爱云,等. 藻胆蛋白与血卟啉衍生物光敏剂的光毒性比较[J]. 汕头大学医学院学报,2005,18(4):193-196.

[43]蔡春尔,李春霞,潘鸣,等. 条斑紫菜藻红蛋白光动力抑制BEL-7402细胞初探[C]. 中国藻类学会第八次会员代表大会暨第十六次学术讨论会论文摘要集,2011.