微波辅助酶法优化怀山药多糖提取工艺的研究

王 珺,李玉伟,江 姜,李桂杰,池浩东,杨占群,徐俊杰,*

(1.吉林医药学院公共卫生学院,吉林吉林 132013; 2.吉林医药学院临床医学院·附属医院,吉林吉林132013; 3.吉林医药学院基础医学院,吉林吉林 132013)

山药,薯蓣科薯蓣属植物[1],其活性成分主要有多糖、皂苷、酚类等[2],其中山药多糖作为一种研究较多的活性成分,具有降血脂、抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力、抗突变[3-5]等多种功能,进行山药多糖的产业开发将具有良好的前景,因此进行山药多糖工艺优化研究,有效提高山药多糖的提取率具有重要意义。

目前多糖提取方法主要有水浴浸提法、酶法、微波法、超声辅助法[6]、逐步醇沉法[7]等。常规的浸提法效率低。酶解法可以作用于细胞壁,充分释放多糖,作用条件相对温和,提取效率高,但受实验条件影响较大。微波法原理为热效应破壁[8],该方法简便易操作,提取速度快,效率高。应用微波辅助,水浴浸提山药多糖[9],可提高提取效率。考虑利用微波辅助酶解进行提取可作为一种提取山药多糖的新思路。

根据已有研究,怀山药中多糖含量丰富[10],但怀山药多糖的提取率仍有待提高。本研究以怀山药为原料,采用微波辅助酶解联合作用的方法,以多糖提取率为检测指标,探究浸提温度、浸提时间、料液比、微波功率对怀山药多糖提取率的影响。通过正交实验确定多糖提取的最优条件,Sevage法除蛋白,优化怀山药多糖的提取工艺,为怀山药多糖的进一步研究与工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

怀山药片(怀山药自然风干制成) 吉林亚泰明星制药有限公司;α-淀粉酶(40000 U/mg)、纤维素酶(11000 U/mg) 长春锦能生物技术有限公司;蒽酮、葡萄糖标准品 国药集团化学试剂有限公司;考马斯亮蓝 中科院新疆化学所生化试剂厂;牛血清蛋白 BBI;氢氧化钠、盐酸、氯仿、正丁醇、硫酸、无水乙醇 皆为国产分析纯试剂。

HH-601型超级恒温水浴锅 金坛市华峰仪器有限公司;PH05型电热恒温干燥箱 上海实验仪器厂;721型可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司;FA1104N型电子天平 上海精密科学仪器有限公司;PJ23C-SC1美的微波炉 广东美的微波炉制造有限公司;JYL-C020型九阳豆浆机 九阳股份有限公司;TDZ5-WS低速多管架自动平衡离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 山药多糖的提取 取怀山药片,利用豆浆机粉碎制成怀山药粉,精确称取5.0 g干燥山药粉末,加入适量蒸馏水,调节溶液至最适pH,加入0.05 g淀粉酶和0.005 g纤维素酶[8-12],55 ℃热水浴酶解1 h,期间玻璃棒缓慢手动搅拌。取出后于微波炉中进行微波辐射处理1 min[13],之后在热水浴中浸提,再次手动搅拌。浸提完成后,静置冷却离心(3000 r/min,15 min)收集上清液。按照上清液∶无水乙醇=1∶4的体积比,在冷却后的上清液中加入无水乙醇,充分混合后静置过夜,得山药粗多糖。用Sevage试剂洗涤3次,并用考马斯亮蓝法检测蛋白质含量,烘干后得到白色粉末状多糖。

1.2.2 标准曲线的绘制及多糖含量的测定 精密称取葡萄糖标准品0.1023 g于1000 mL容量瓶中,加蒸馏水至刻度(100 mg/L),摇匀,备用。分别吸取葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于试管中,分别加入蒸馏水至体积为1.0 mL,空白管加入1.0 mL蒸馏水做对照,各管中加入4.0 mL蒽酮试剂,迅速浸于冰水浴中冷却,后摇匀置沸水浴加热10 min,取出置冷却至室温,在紫外分光光度计波长620 nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度(ug/mL)为横坐标,吸光度为横坐标绘制标准曲线。得到标准曲线y=0.0012x+0.0049(y为吸光度,x为葡萄糖浓度,mg/mL),R2=0.9998。多糖含量测定:精密称取山药粗多糖0.1037 g加蒸馏水溶于1000 mL量瓶中,精确吸取1 mL置于试管内,按照蒽酮-硫酸法处理后于620 nm处测定其吸光度,代入葡萄糖标准曲线得山药多糖样品含量。多糖提取率计算公式为:

多糖提取率(%)=G1/G2×100

式中:G1为提取的山药多糖质量,g;G2为山药粉质量,g。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 浸提温度对怀山药多糖提取率的影响 固定料液比为1∶5,浸提时间为3 h,浸提2次,微波功率为750 W,探究不同浸提温度(75、80、85、90、95 ℃)对怀山药多糖提取率的影响。

1.2.3.2 浸提时间对怀山药多糖提取率的影响 固定料液比为1∶5,浸提温度为85℃,浸提2次,微波功率为750 W,探究不同浸提时间(1、2、3、4、5 h)对怀山药多糖提取率的影响。

1.2.3.3 料液比对怀山药多糖提取率的影响 固定浸提温度为85 ℃,浸提时间为3 h,浸提2次,微波功率为750 W,探究不同料液比(1∶4.5、1∶5.0、1∶5.5、1∶6.0、1∶6.5 g/mL)对怀山药多糖提取率的影响。

1.2.3.4 微波功率对怀山药多糖提取率的影响 固定料液比为1∶5,浸提时间为3 h,浸提2次,根据文献[14-15],微波功率过高,多糖提取率下降,故选取不同微波功率(600、675、750、825、900 W),探究其对怀山药多糖提取率的影响。

1.3 正交实验

在单因素实验的基础上选取浸提温度(A)、浸提时间(B)、料液比(C)和微波功率(D)4个因素,设置3个水平,以多糖提取率为考察指标,设计L9(34)正交实验优化山药多糖提取工艺。因素与水平见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of orthogonal experiment

1.4 数据统计分析

应用SPSS 20.0软件分析单因素实验数据的显著性差异。采用单因素方差分析进行各水平间差异的比较,LSD-t检验进行两两比较。结果以Mean±SD表示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 浸提温度对怀山药多糖提取率的影响 由图1可看出,当温度在75～80 ℃时,多糖的提取率随着浸提温度的增高而略有升高,温度在80～85 ℃范围内,多糖提取率随温度上升略有下降,通过对二者两两比较分析得p>0.05,故在此范围内,多糖提取率无显著性差异。当温度达到85～95 ℃范围内,多糖提取率随温度上升而显著升高,原因可能是，由于温度升高,多糖溶解度和扩散率升高,使提取率不断升高,在95 ℃时多糖提取率达到27.04%。基于文献与前期实验[16-17],选取85、90、95 ℃三个水平进行正交实验。

图1 提取温度对山药多糖提取率的影响Fig.1 Effect of temperature on the polysaccharide yield注：字母不同表示有显著差异(p<0.05),图2～图4同。

2.1.2 浸提时间对怀山药多糖提取率的影响 由图2可看出,浸提时间在1～3 h范围内,多糖的提取率随着浸提时间的延长而升高,浸提时间在3～4 h范围内,多糖提取率随浸提时间的延长而略有下降,浸提时间在4～5 h范围内,多糖提取率呈上升趋势,可能是由于时间过长,多糖的结构遭到破坏,导致多糖提取率下降[17-18]。结果表明,3 h时多糖提取率最高,达27.4%,选取2、3、4 h三个水平进行正交实验。

图2 浸提时间对多糖提取率的影响Fig.2 Effect of time on the polysaccharide yield

2.1.3 料液比对怀山药多糖提取率的影响 由图3可看出,当料液比在1∶4.5～1∶5.0范围内,多糖的提取率随料液比增大而显著升高,当料液比在1∶5～1∶6.5范围内,多糖的提取率随料液比增大而下降,原因可能是由于水量增加,溶解的杂质增多,影响多糖的提取[19]。当料液比为1∶5时,多糖提取率达到33.67%,选取1∶4.5、1∶5.0、1∶5.5三个水平进行正交实验。

图3 料液比对多糖提取率的影响Fig.3 Effect of material liquid ratio on the polysaccharide yield

2.1.4 微波功率对怀山药多糖提取率的影响 由图4可看出,怀山药多糖的提取率随微波功率的升高而显著提高。王安良等采用微波辅助法得到多糖提取率为13%[20-21],而本实验在微波功率900 W条件下,得多糖提取率为33.03%,提取率有显著提高,原因可能由于微波功率升高,热效应导致细胞破裂多糖释放,进而进行水浴浸提,多糖充分溶解提取率升高,但温度过高,多糖降解。选取750、825、900 W三个水平进行正交实验。

图4 微波功率对多糖提取率的影响Fig.4 Effect of microwave power on the polysaccharide yield

2.2 正交实验

根据单因素实验结果,确定微波辅助提取山药多糖的最佳条件,实验结果见表2。

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2得：各因素对多糖产率的影响为：RC>RD>RA>RB,即料液比>微波功率>浸提温度>浸提时间,山药多糖的最佳提取条件为A1B3C3D2，即提取温度为85 ℃,提取时间为4 h,料液比1∶5.5 (g/mL),微波功率为825 W,此时山药多糖的产率为34.78%±1.19%。

3 结论与讨论

多糖是一种结构复杂用途广泛的物质,可从各种动植物、真菌等物质中提取。提取怀山药多糖的方法主要有水提醇沉法、酶提取法、超声提取法、微波提取法、超高压提取法、膜分离法等[7]。传统的水浴浸提法提取率3.37%[8],微波法为8.35%[14],纤维素酶酶解法山药多糖提取率8%[23],α-淀粉酶酶解法为11.5%[24],酶解法优势在于作用条件温和,保持物质原有活性,微波法具有提取效率高、提取速度快、易操作等优点。本研究考虑综合酶法和微波法的优点,运用微波辅助法通过热效应,使怀山药溶液内部温度升高,加入α-淀粉酶与纤维素酶,可以溶解怀山药表面淀粉颗粒,分解细胞壁,促进怀山药多糖的释出。通过单因素分析及正交实验,建立并优化了微波辅助与酶解联合作用提取怀山药多糖的工艺,确定最佳提取条件为温度85 ℃,提取时间4 h,料液比1∶5.5 (g/mL),微波功率为825 W,在此条件下怀山药多糖的提取率可达34.78%±1.19%,与传统的水浴浸提法[22]及单纯的酶法[23]、微波辅助法[14]相比,本实验提取率有显著提高。此外,根据王莉[25]等在微波辅助提取米糠多糖及张玲玲、赵希艳[25-26]等在研究中进行验证实验,确定了微波辅助与酶解法提取怀山药多糖不改变其理化性质。本实验为怀山药多糖提取工艺优化提供了依据,也为后续研究怀山药多糖的理化性质打下坚实基础。

研究表明,山药多糖有增强免疫力、降血糖降血脂等功效[7],有良好的开发前景。山药作为高糖、无脂肪的天然保健品,在我国的种植开发极为广泛,但山药的开发利用还仅限于制作复合饮料或山药饮片、山药粉的初级阶段,而未能高效利用山药多糖的优质作用。本研究立足于山药多糖开发的巨大潜力,为后续山药多糖的活性研究及产业化开发奠定基础。

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