耐冬山茶基因组DNA的提取及CDDP引物的筛选

隽逸豪 ，王绍霞 ，李春艳 ，马 燕 ，臧德奎 *

（1.山东农业大学林学院，山东 泰安 271018；2.枣庄市山亭区国有山亭林场，山东 枣庄 277200；3.枣庄市山亭区林业局，山东 枣庄 277200）

山茶（Camellia japonica）是我国十大名花之一，栽培历史悠久，品种繁多，具有极高的观赏价值与经济价值。其野生种群仅分布于江西、浙江、台湾、四川、山东等省区，山东为其自然分布的北界，仅见于山东青岛近海岛屿大管岛、长门岩岛，与大叶胡颓子（Elaeagnus macrophylla）等植物形成常绿阔叶矮林，这种特殊的生物地理现象对于研究植物区系分布和山茶属的系统演化具有重要意义[1]。该地区的野生山茶又称“耐冬”，是一种北方罕有的冬季观花植物，也是山茶育种的珍贵种质资源。由于生境的破坏及对现有资源的不合理开发利用，现存的野生山茶数量越来越少，亟待保护。

遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，影响物种的长期存在与进化，已经成为生物多样性研究的热点内容之一[2]。现代分子标记技术是植物遗传育种研究的重要工具，基因组DNA的提取质量是影响实验成败的关键因素[3]。山茶叶片中含有多种次生代谢物质，如酚类、多糖等，这些物质的存在很大程度上影响了其基因组DNA的提取和分离，因此，选择适当的提取方法以减轻这些物质对所得基因组DNA的影响是一项十分重要的工作。

CDDP标记是Collard和Mackill等于2009年开发的一种基于DNA保守序列的新型分子标记方法，是基于单引物扩增反应的标记技术。在植物的基因或基因家族中的保守氨基酸序列是典型的保守结构功能区域，其对应的DNA序列在不同物种间也是相当保守的。根据这些保守序列设计引物，实现对样本的PCR扩增。该技术具有操作简单、应用成本低、多态性丰富、重复性好等优点，其引物具有通用性，能产生丰富的遗传信息[4]。在遗传育种、亲缘关系分析、品种分类鉴定工作中有重要作用。目前已应用于水稻（Oryza sativa）[5]、欧白英（Solanum dulcamara）[6]、 牡丹 （Paeonia suffruticosa）[7-8]、 菊花（Chrysanthemum×morifolium）[9]等植物种质资源的遗传多样性分析。目前国内外对山茶的研究多采用ISSR[10]、AFLP[11]、等位酶技术[12]等技术手段 ，未见CDDP技术应用于该领域的报道。

本实验力图找到适宜的耐冬山茶基因组DNA提取方法，筛选出高效的CDDP引物，为耐冬山茶的遗传多样性研究提供新的技术手段。

1 材料与方法

1.1 耐冬山茶基因组DNA的提取

1.1.1 实验材料

实验材料为采自大管岛、长门岩岛的共110份山茶幼嫩叶片。采集后立即加入硅胶干燥，密封保存于-20℃冰箱待用。

1.1.2 实验仪器

低温高速离心机；电泳仪；水浴锅；紫外分光光度计；凝胶成像分析系统。

1.1.3 试剂

EDTA（pH 8.0）；Tris-HCl（pH 8.0）；2×CTAB 缓冲液（配方见表 1）；提取介质（配方见表 2）；PVP；β-巯基乙醇；氯仿-异戊醇（v：v=24：1）；70%乙醇；无水乙醇；1×TE；双蒸水（ddH2O）；NaAc。

表 1 2×CTAB缓冲液配方Table1 The formulation of 2×CTAB buffer solution

表2 提取介质配方Table 2 The formulation of extraction medium

1.1.4 实验方法

1.1.4.1 准备工作

①将离心管、移液器枪头、提取介质等进行高压蒸汽灭菌；②将离心管（2 mL、1.5 mL）标好编号；③打开水浴锅升温至65℃，将2×CTAB缓冲液置于水浴锅中预热备用；④用液氮预冷研钵和药匙。

1.1.4.2 DNA 的提取

①称取样品0.2 g倒入灭菌干燥的研钵中，加入约30 mL液氮，少量PVP进行研磨。重复加入液氮2-3次充分研碎使样品呈均匀粉末状，迅速转移至装有1 mL提取介质的2 mL离心管中，冰盒内静置10 min。使用低温高速离心机7000 r/min，4℃条件下离心10 min。②弃去上清液。向沉淀中再次加入1 mL提取介质，震荡至沉淀散开，放入冰盒，静置 10 min。7000 r/min，4℃条件下离心 10 min。③弃去上清液，向沉淀中加入40 μL β-巯基乙醇，800 μL CTAB摇匀至沉淀散开，放入65℃水浴锅中水浴加热60 min，15 min左右颠倒混匀一次。④处理完毕后将离心管从水浴锅中取出，冷却至室温，加入 400 μL TRIS 平衡酚，400 μL 氯仿异戊醇 （v：v=24：1），混匀，室温下放置 10 min。 12000 r/min，4 ℃条件下离心10 min。⑤取上清液800 μL（每次取200 μL）加入新的2 mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇（v：v=24：1），轻轻转摇试管使溶液充分混匀，10 min。12000 r/min，4 ℃条件下离心 10 min。⑥观察离心管中液体，若中间蛋白层较多可重复步骤⑤。若蛋白质去除已较完全，用剪去尖端的1 mL枪头取上清液 400 μL（每次取 100 μL）转移到 1.5 mL离心管中，先加入 1/10 体积（40 μL）的 NaAc，再加入 2 倍体积（800 μL）的无水乙醇（-20 ℃），-20 ℃放置20 min。取出离心管，12000 r/min，4℃条件下离心3 min。⑦弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2～3次，室温下干燥，使乙醇挥发。每管加入50 μL 1×TE溶解沉淀，-20℃保存。

1.1.5 DNA样品的检测

使用琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度法检测所得DNA样品。检测前在样品中加入RNA酶1μL，37℃水浴1 h，除去RNA。

1.1.5.1 琼脂糖凝胶电泳

图1 部分DNA样品琼脂糖凝胶电泳检测结果

取 5 μL DNA 样品， 加入 2 μL 6 × Loading Buffer混匀，在0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压120 V，30 min。电泳结束后EB染色5min，使用凝胶成像系统观察采集图像。

1.1.5.2 紫外分光光度法

光吸收比是检验DNA纯度的重要指标，纯净的DNA的A260/A280为1.80左右。使用紫外分光光度计检测DNA样品在260 mm、280 mm波长处的吸收值。

1.2 CDDP引物的筛选

实验使用的CDDP引物由上海生工生物有限公司公司合成，编号见表3。

1.2.1 CDDP-PCR体系

选取大管岛、长门岩岛两个地区的4份样品，通过数次反应体系试验确定最佳PCR反应体系为2×Es Taq MasterMix（含染料）酶 10 μL、10 pmol·μL-1引物 1.0 μL、30 ng·μL-1DNA 模板 2.0 μL 及 ddH2O7μL。

表3 21条CDDP引物信息Table 3 The imformation of 21 CDDP primers

反应过程为94℃预变性3 min；94℃变性 1 min，50℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，35个循环；72℃后延伸5 min。

1.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测

取6 μL扩增产物，以5 V/cm的电压在2%琼脂糖凝胶上电泳1～2 h，EB染色5 min，使用凝胶分析系统观察采集图像。

2 结果分析

2.1 基因组DNA的提取

对提取的DNA样品的检测结果表明，改良CTAB法得到的DNA电泳带形好，主带清晰，无弥散现象（图1）。DNA样品的A260/A280在1.71～1.84之间，纯度高。

2.2 CDDP引物的筛选

据21条CDDP引物的扩增结果 （表4），引物Pr2、Pr11、Pr12、Pr18 未扩增出任何条带， 引物 Pr21扩增条带少，多态性不高；引物 Pr8、Pr13、Pr15、Pr17、Pr19虽得到数量较多的条带，但其多态性比率不高。其余引物均得到清晰且多态性丰富的条带。引物Pr3、Pr5、Pr9的多态性比率最高达100%。综合引物的鉴别力及扩增效果，从21条引物种筛选 出 11 条 （Pr1、Pr3、Pr4、Pr5、Pr6、Pr7、Pr9、Pr10、Pr14、Pr16、Pr20）多态性好，条带清晰的引物用于后续的CDDP分子标记。其中，多态性比率最的为Pr3、Pr5、Pr9， 态性比率达100%， 最低的 Pr4，为71.43%。

3 讨论

高质量的基因组DNA是开展植物分子生物学研究之基础，由于植物细胞化学成分的差异，对其基因组DNA的提取需要采取不同策略[13]。本实验根据山茶叶片次生代谢产物多，难以获得高质量的基因组DNA的特点，在在传统的CTAB及多种改良CTAB法的基础上进行改进[14]，如加入PVP、β-巯基乙醇等还原性物质消除酚类氧化对DNA的影响；延长加入CTAB后的水浴时间使细胞膜充分裂解，释放更多的 DNA；增加使用氯仿-异戊醇（v：v=24：1）的抽提次数，充分除去叶片中的蛋白质；用乙醇洗涤沉淀前加入3 mol·μL-1的NaAc溶液，除去多糖。经检测，采用本法所得耐冬山茶基因组DNA的纯度和得率均较高，能够满足分子实验要求。

CDDP作为一种新型分子标记技术，具有操作简便、稳定性和重复性好、多态性丰富、引物具有通用性等优势[5]，在物种亲缘关系和遗传多样性分析中有重要应用价值。本实验使用21条CDDP引物对随机选取的大管岛、长门岩岛的山茶基因组DNA在 20 μL ，包含 2×Es Taq MasterMix（含染料）酶 10 μL、10 pmol·μL-1引物 1.0 μL、30 ng·μL-1DNA 模板2.0 μL及ddH2O 7 μL的反应体系下进行扩增。共得到11条条带清晰、多态性丰富、鉴别力强的引物，用于后续的CDDP分子标记。在11条引物中，多态性比率最高的为Pr3、Pr5、Pr9，其多态性比率达100%，多态性比率最低的为Pr4，其多态性比率为71.43%。

表4 21条引物对样品的扩增结果Table 4 Amplification results of 21 primers

实验表明，CDDP分子标记在耐冬山茶种质资源的遗传多样性分析方面具有应用可行性，为CDDP-PCR技术对耐冬山茶种质资源的亲缘关系及其遗传变异的研究奠定了基础。

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