氘代沃拉帕沙的设计与合成

黄 雨,刘保民,刘戌时,张寅生

(正大天晴药业集团股份有限公司,江苏省抗病毒靶向药物研究重点实验室,南京 210023)

沃拉帕沙[((1R,3aR,4aR,6R,8aR,9S,9aS)-9-((E)-2-(5-(3-氟苯基)吡啶-2-基)乙烯基)-1-甲基-3-氧代十二氢萘并[2,3-c]呋喃-6-基)氨基甲酸乙酯]是默沙东公司首创的蛋白酶激活受体1(PAR-1)拮抗剂，是一种抗血小板制剂，旨在减少血小板聚集倾向，抑制血凝凝块的形成[1]。2014年5月8日获FDA批准，用于心脏病发作患者或腿部动脉栓塞患者，以降低进一步心脏病发作和脑卒中等风险[2]。

近年来，稳定同位素标记的化合物已经广泛的运用于药物的临床研究当中[3]，由于氘同位素与其他稳定同位素(如13C,15N)相比价廉易得,故最为常用。为满足开展沃拉帕沙生物等效性试验时样品分析检测的需要，本研究拟合成稳定同位素氘标记的沃拉帕沙,沃拉帕沙的高分辨质谱显示M+3仍有明显出峰(0.68%)，所以需向沃拉帕沙分子中至少引入4个氘原子以避免原研药M+3质谱峰对氘代化合物主峰的影响。

制备氘代药物分子有下列3种常用的方法:①以市售的氘代小分子化合物(如氘代甲醇或氘代乙醇)为氘代源,通过一步或多步反应制备氘代药;②用氘代还原试剂(如LiAlD4,NaBD4)为氘代源,还原不饱和键来制备氘代药;③在金属或酸碱催化下,用氘代水(D2O)直接与药物分子进行氢(H)-氘(D)交换来制备氘代药(此法最为高效)。当然,不同的药物分子有时需要设计不同的引入氘原子的途径,本文采用了①和③组合的途径来制备所需的氘代沃拉帕沙。

1 材 料

1.1 试 剂

除特殊注明外，所有反应均在干燥的反应瓶中通氮气搅拌进行。采用硅胶GF254薄板(青岛海洋化工厂)作薄层色谱分析，柱色谱采用烟台康必诺化学试剂厂生产的硅胶(200～300目)装柱。沃拉帕沙(1)和中间体5[((1R,3aR,4aR,6R,8aR,9S,9aS)-9-(二苯基氨基甲酰基)-1-甲基-3-氧代十二氢萘并[2,3-c]呋喃-6-基)氨基甲酸对硝基苯酯]由正大天晴药业集团合成研究所提供，其他所有商业化试剂均为市售化学纯或分析纯产品，除特别说明外，未经处理直接使用。氘代硫酸(D2SO4,D≥99.5%)和氘代乙醇(C2D5OD,D≥99.5%)购自Sigma-Aldrich上海贸易有限公司。

1.2 仪 器

1H NMR和13C NMR在Bruker AM-500型核磁共振仪上测定，以TMS为内标。高分辨质谱采用AB SCIEX Triple TOF 4600高分辨质谱仪测定。液相色谱质谱联用采用Agilent-ABI LC/MS 3200Q-Trap光谱仪测定。熔点采用BUCHI B-545熔点仪测定。

2 合成路径

2.1 以氘代浓硫酸为氘源，对沃拉帕沙进行直接氢氘交换

如表1所示，沃拉帕沙(1)与D2SO4在50 ℃下，反应16 h后，高分辨质谱显示主要以D3为主，并且存在少量D0。纯化后进行二次氘代，仍是以D3为主，D4没有增多的趋势。LC-MS显示没有D0存在。在该条件下，原料降解不明显。UPLC纯度在90%左右；尝试升高温度至80 ℃，LC-MS显示仍是以D3为主，原料降解明显。结合核磁和高分辨质谱，初步判断氢-氘交换主要发生在氟代芳环的邻位和对位。在酸性条件下，吡啶环活性降低，在上述条件下未发现氢-氘交换现象发生。

Table1 Hydrogen-deuterium exchange of vorapaxar under concentrated D2SO4conditions

Entryt/hT/°CIsotope abundance of compound 1a/%11650[Ma+3]:100;[M+4]:26.7;[M+2]:17.2;[M+5]:4.9;[M+1]:1.5;[M]:0.3921280[M+3]:100;[M+4]:36.8;[M+2]:15.8;[M+5]:5.3;[M+1]:1.1

Reagents and conditions:Compound1(0.4 mmol),D2SO4(16 mmol);aHRMS (m/z[M+H]+) of compound1

2.2 以沃拉帕沙为起始原料合成[D5]沃拉帕沙(4)

以沃拉帕沙(1)为起始原料(路线1)，在盐酸和冰醋酸混合体系下高温水解得到化合物2[4]，收率为98.7%。化合物2在三乙胺存在下与氯甲酸对硝基苯酯缩合得到化合物3，收率为37.9%，此步反应收率较低，有可能是实验过程中使用的氯甲酸对硝基苯酯变质所致。化合物3在三乙胺下与购买的氘代乙醇([D6]CD3CD2OD)进行酯交换反应生成化合物4，收率为82%。高分辨质谱显示氘代化合物4存在着0.25%未标记的沃拉帕沙(图1)。由于本研究是以未标记的沃拉帕沙为起始原料，所以其原因有可能是原料3中存在微量未反应的沃拉帕沙所致。为了排除这个因素，本研究以中间体5为原料在三乙胺下与同一批次的氘代乙醇进行酯交换反应合成化合物6，结果显示仍存在0.7%左右的未标记乙醇进行酯交换的副产物(图2)。所以初步判断，市售的氘代乙醇(如[D6]CD3CD2OD)会含有微量的未标记乙醇(CH3CH2OH)，从而导致内标物不合格。

Scheme1 Synthetic route of [D5]vorapaxar (4)

Reagents and conditions:(a) HCl/AcOH,118 °C,6 h;(b) 4-Nitrophenyl chloroformate (1.2 eq.),TEA (2 eq.),DCM,r.t.,30 min;(c) Ethanol-d6(50 eq.),TEA (3 eq.),65 °C,1.5 h

Figure1 HRMS (m/z[M+H]+) of compound4

Figure2 Synthesis and HRMS (m/z[M+H]+) of compound6

2.3 以[D5]沃拉帕沙为起始原料合成[D8]沃拉帕沙(7)

为了消除D0的存在，以氘代浓硫酸为氘源，再对化合物4进行氢-氘交换(路线2)。50 ℃条件下，氘代浓硫酸中，反应16 h后，以56.7%的收率得到化合物7。高分辨质谱显示化合物7主要以D8为主，没有未标记的沃拉帕沙存在(图3)。HPLC纯度为99.47%，满足内标化合物的使用需求。结合氢谱和碳谱，初步判断氢-氘交换主要发生在氟代芳环的邻位和对位。

3 合成步骤及产物结构表征

3.1 ((1R,3aR,4aR,6R,8aR,9S,9aS)-9-((E)-2-(5-(3-氟[2,4,6-D3]苯基)吡啶-2-基)乙烯基)-1-甲基-3-氧代十二氢萘并[2,3-c]呋喃-6-基)氨基甲酸乙酯(1a)

单口瓶中，依次加入沃拉帕沙(1，0.2 g,0.406 mmol)和[D2]浓硫酸(1.625 g,16.24 mmol)，N2保护下加热到50 ℃反应16 h，反应结束后用碳酸钾溶液调节pH至碱性，然后向其中加入乙酸乙酯(50 mL)，萃取分液，水相用乙酸乙酯(50 mL)再次萃取，合并有机相，分别用水(50 mL)和饱和食盐水(50 mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后，硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯(2∶1)为洗脱剂得到白色粉末状固体0.073 g，产率36.3%。mp:124～125 ℃；1H NMR (500 MHz,DMSO-d6)δ:8.89(1H,s,Ar-H),8.12(1H,d,J=10 Hz,Ar-H),7.55～7.53(2H,m, Ar-H,NH),7 .03(1H,d,J=10 Hz,Ar-H),6.72～6.67(1H,m,C==CH),6.60(1H,d,J=15 Hz,C==CH),4.87～4.83(1H,m,CH),3.99～3.94(2H,m,OCH2CH3),3.42(1H,s,CH),2.68～2.65(1H,m,CH),2.38～2.31(2H,m,2×CH),1.80～1.68(4H,m,2×CH2),1.31(3H,d,J=5 Hz,CH3),1.20～1.18(2H,m,CH2,CH),1.16～1.14(5H,m,OCH2CH3,CH2,CH),1.02～0.96(1H,m,CH2),0.89～0.83(1H,m,CH2)。13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:177.92,164.13,162.19,155.92,154.46,147.75,139.58,139.51,138.15,135.63,132.91,131.35,131.29,130.38,121.88,76.56,59.77,49.46,48.60,45.04,41.81,38.34,32.90,31.44,30.43,26.81,22.19,15.16。HRMS(ESI) Calcd.for C29H31D3FN2O4([M+H]+)m/z:496.269 1,Found:496.279 4。

Scheme2 Synthetic route for [D8] vorapaxar (7)

Figure3 HRMS (m/z[M+H]+) of vorapaxar (A) and [D8] vorapaxar (B)

3.2 (3R,3aS,4S,4aR,7R,8aR,9aR)-7-氨基-4-((E)-2-(5-(3-氟苯基)吡啶-2-基)乙烯基)-3-甲基十二氢萘并[2,3-c]呋喃-1(3H)-酮(2)

150 mL耐压瓶中，依次加入沃拉帕沙(1，3 g,6.09 mmol)、盐酸(48.0 g,40 mL,1 317 mmol)和冰醋酸(20.98 g,20 mL,349 mmol)，将混合物加热到118 ℃反应6 h。反应结束后，向其中缓慢滴加饱和NaHCO3溶液(100 mL)调节pH至碱性，加入二氯甲烷(100 mL)萃取分液(乳化严重)，水相用二氯甲烷(60 mL)再次萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液浓缩，抽干得到白色粉末状固体2.22 g，产率98.7%。mp:112～113 ℃；1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:8.69(1H,s,Ar-H),7.74(1H,d,J=5 Hz,Ar-H),7.38～7.34(1H,m,Ar-H),7.29～7.27(1H,m,Ar-H),7.20～7.18(2H,m,Ar-H),7.03～7.00(1H,m,Ar-H),6.55～6.44(2H,m,2×C==CH),4.67(1H,s,CH),2.66～2.61(2H,m,2×CH),2.31～2.26(2H,m,2×CH),1.89～1.86(1H,m,CH2),1.81～1.79(3H,m,CH2,CH2),1.36(3H,d,J=5 Hz,CH3),1.23～1.16(1H,m,CH),1.13～0.99(3H,m,CH2,CH),0.88～0.82(2H,m,CH2)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:177.91,(164.27,162.31),154.13,148.11,(139.87,139.80),136.55,134.89,133.82,130.78,(130.72,130.66),(122.54,122.52),121.55,(115.00,114.83),(113.898,113.71),76.82,50.15,49.07,45.49,43.65,42.22,40.94,38.67,36.45,31.82,30.43,22.11。MS(ESI):m/z421.49[M+H]+。

3.3 ((1R,3aR,4aR,6R,8aR,9S,9aS)-9-((E)-2-(5-(3-氟苯基)吡啶-2-基)乙烯基)-1-甲基-3-氧代十二氢萘并[2,3-c]呋喃-6-基)氨基甲酸对硝基苯酯(3)

三口瓶中加入化合物2(0.5 g,1.189 mmol)，二氯甲烷(17 mL)和三乙胺(0.241 g,0.331 mL,2.378 mmol)，氮气保护下将混合物降温至0 ℃。向其中加入氯甲酸对硝基苯酯(0.288 g,1.427 mmol)，然后升至室温反应30 min。反应结束后，反应液浓缩，硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯(2∶1)为洗脱剂得到白色粉末状固体0.314g，产率37.9%。mp:145～146 ℃；1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:8.70(1H,s,Ar-H),8.16(2H,d,J=5 Hz,Ar-H),7.76(1H,d,J=5 Hz,Ar-H),7.39～7.35(1H,m,Ar-H),7.29(1H,d,J=5 Hz,Ar-H),7.24～7.19(4H,m,Ar-H),7.04～7.01(1H,m,Ar-H),6.57～6.47(2H,m,2×C==CH),5.02(1H,d,J=10 Hz,CH),4.69～4.66(1H,m,NH),3.56～3.54(1H,m,CH),2.65～2.64(1H,m,CH),2.34～2.30(2H,m,2×CH),2.07～2.05(2H,m,CH2),1.92～1.87(2H,m,CH2),1.38(3H,d,J=5 Hz,CH3),1.21～1.09(4H,m,CH2,2×CH),1.02～0.89(2H,m,CH2)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:177.72,(164.25,162.30),155.89,153.85,152.25,148.07,144.75,(139.74,139.68),135.94,135.03,133.99,130.97,(130.75,130.69),125.10,(122.54,122.51),121.93,121.86,(115.07,114.91),(113.88,113.71),76.81,50.17,48.85,45.24,41.99,40.71,39.78,38.46,32.89,31.57,30.17,22.11。MS(ESI):m/z586.59[M+H]+。

3.4 ((1R,3aR,4aR,6R,8aR,9S,9aS)-9-((E)-2-(5-(3-氟苯基)吡啶-2-基)乙烯基)-1-甲基-3-氧代十二氢萘并[2,3-c]呋喃-6-基)氨基甲酸[D5]乙酯(4)

单口瓶中，依次加入化合物3(0.14 g,0.239 mmol)和[D6]乙醇(0.624 g,0.7 mL,11.98 mmol)，将其置于60 ℃油浴中，然后向其中加入三乙胺(0.073 g,0.100 mL,0.717 mmol)，混合物在60 ℃下搅拌反应1.5 h。反应结束后，反应液浓缩，硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯(1∶1)为洗脱剂得到白色粉末状固体0.17 g，产率82%。mp:125～126 ℃；1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:8.70(1H,d,J=2.5 Hz,Ar-H),7.75～7.73(1H,m,Ar-H),7.39～7.34(1H,m,Ar-H),7.28(1H,d,J=8 Hz,Ar-H),7.21～7.17(2H,m,Ar-H),7.04～7.00(1H,m,Ar-H),6.56～6.51(1H,m,C==CH),6.47(1H,d,J=15.5 Hz,C==CH),4.69～4.63(1H,m,CH),4.46(1H,br.s,NH),3.46(1H,br.s,CH),2.66～2.61(1H,m,CH),2.33～2.27(2H,m,2×CH),1.99～1.94(2H,m,CH2),1.89～1.81(2H,m,CH2),1.36(3H,d,J=6.0 Hz,CH3),1.19～1.18(2H,m,CH2,CH),1.07～1.00(2H,m,CH2,CH),0.93～0.85(2H,m,CH2)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:177.72,(164.25,162.29),155.87,153.98,148.11,(139.84,139.78),136.15,134.90,133.85,130.88,(130.71,130.65),(122.53,122.50),121.73,(115.00,114.83),(113.87,113.69),76.75,49.52,48.94,45.29,42.03,40.78,40.22,38.53,33.23,31.60,30.21,22.10。HRMS(ESI) Calcd.for C29H29D5FN2O4([M+H]+)m/z:498.281 6,Found:498.281 5。

3.5 ((1R,3aR,4aR,6R,8aR,9S,9aS)-9-(二苯基氨基甲酰基)-1-甲基-3-氧代十二氢萘并[2,3-c]呋喃-6-基)氨基甲酸[D5]乙酯(6)

单口瓶中，依次加入中间体5(0.2 g,0.343 mmol)和[D6]乙醇(0.894 g,1 mL,17.15 mmol)，将其置于60 ℃油浴中，然后向其中加入三乙胺(0.104 g,0.143 mL,1.03 mmol)，混合物在60 ℃下搅拌反应1.5 h。反应结束后，反应液浓缩，硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯(1∶1)为洗脱剂得到白色粉末状固体0.11 g，产率60%。mp:195～196 ℃；HRMS(ESI) Calcd.for C29H30D5N2O5([M+H]+)m/z:496.286 0,Found:498.285 7。

3.6 ((1R,3aR,4aR,6R,8aR,9S,9aS)-9-((E)-2-(5-(3-氟[2,4,6-D3]苯基)吡啶-2-基)乙烯基)-1-甲基-3-氧代十二氢萘并[2,3-c]呋喃-6-基)氨基甲酸[D5]乙酯(7)

单口瓶中，依次加入化合物4(0.3 g,0.603 mmol)和[D2]浓硫酸(2.413 g,24.11 mmol)，N2保护下加热到50 ℃反应16 h。反应结束后用碳酸钾溶液调节pH至碱性，然后向其中加入乙酸乙酯(50 mL)，萃取分液，水相用乙酸乙酯(50 mL)再次萃取，合并有机相，分别用水(50 mL)和饱和食盐水(50 mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后，硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯(2∶1)为洗脱剂得到白色粉末状固体0.172 g，产率56.7%。mp:126～127℃；1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:8.79(1H,d,J=2 Hz,Ar-H),7.84～7.82(1H,m,Ar-H),7.45(1H,d,J=5.5 Hz,Ar-H),7.27(1H,d,J=8 Hz,Ar-H),6.61～6.54(2H,m,2×C==CH),4.75～4.73(1H,m,CH),4.50(1H,br.s,NH),3.52(1H,br.s,CH),2.72～2.70(1H,m,CH),2.41～2.37(2H,m,2×CH),2.08～2.03(2H,m,CH2),1.98～1.96(1H,m,CH2),1.94～1.90(1H,m,CH2),1.45(3H,d,J=5.5 Hz,CH3),1.29～1.25(2H,m,CH2,CH),1.16～1.12(2H,m,CH2,CH),0.99～0.94(2H,m,CH2)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:177.73,(164.21,162.25),155.88,153.99,148.12,(139.68,139.61),136.16,134.90,133.80,130.89,(130.50,130.43),121.75,76.76,49.51,48.94,45.30,42.04,40.78,40.22,38.53,33.24,31.60,30.21,22.10。HRMS(ESI) Calcd.for C29H26D8FN2O4([M+H]+)m/z:501.300 5,Found:501.306 3[M+H]+。

4 小 结

本研究以未标记的沃拉帕沙为起始原料及氘代乙醇和氘代浓硫酸为氘源，经过水解、缩合、酯交换和氢氘交换4步反应高效地合成以D8为主的氘代沃拉帕沙。所有中间体和终产物均经过核磁和高分辨质谱确证，所制备氘代化合物[D8]沃拉帕沙满足内标化合物的使用要求。值得注意的是市售的氘代乙醇(如[D6]CD3CD2OD)会含有微量的未标记乙醇,从而导致内标物不合格或给制备带来麻烦。

参 考 文 献

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