超声联合高通量测序在检测胎儿短肢畸形中的研究

乞艳华,麻妙艳#,刘 娜,周 琦,雷小莹,贾建坤,邬晋芳

(1西安交通大学第二附属医院超声科,西安 710004;2北京贝瑞和康生物技术有限公司;3西安交通大学第二附属医院妇产科;#共同第一作者;*通讯作者,E-mail:wjf2yuan@126.com)

胎儿短肢畸形是临床常见的出生缺陷之一,病因复杂,种类繁多,产前超声是胎儿骨骼系统发育异常的首选筛查方法。胎儿短肢畸形包括致死性与非致死性,超声预测致死性骨发育不良的准确率高达92%-96%[1]。对于非致死性骨骼发育不全,误诊及漏诊几率较高,出生后因骨骼畸形而致残,甚至引发神经系统各种并发症,给家庭及社会带来极大的精神及经济负担[2,3],故产前及时准确诊断至关重要。孕妇外周血中胎儿游离DNA包含胎儿全基因组信息,无创性产前诊断技术理论上可从胎儿染色体异常扩展至单基因遗传疾病,无创产前基因测序主要用于鉴别新发突变或父源性遗传物质的有无,胎儿短肢畸形大多为自身基因突变,且存在致病热点突变,使其实现产前无创性检测成为可能[4,5]。本研究分析近4年就诊于我院的胎儿短肢畸形病例,探讨超声联合高通量测序在产前诊断胎儿短肢畸形中的临床价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2014-01～2017-12经产前超声筛查胎儿肢体短小的10例孕妇(长骨测量值均低于正常值两倍标准差以上[1])。详细记录孕妇的年龄、身高、孕产次、末次月经、产前检测的项目及内容。所有孕妇均为正常个体,无骨发育不良的相关异常表型,就诊时均无高血压疾病、糖尿病、急性脂肪肝等妊娠期合并症或并发症,肝肾功能未见异常,全部胎儿均依据孕妇末次月经时间及11-13+6周超声中胎儿顶臀长核算孕周。所有研究均在父母知情同意下完成。

1.2 研究方法

超声:采用GE Voluson E8彩色多普勒超声诊断仪,凸阵探头,对胎儿行系统产前超声检查,其中二维探头频率2.5-5.0 MHz,三维容积探头频率为4.0-8.0 MHz。孕妇仰卧位,采用连续顺序追踪超声检查法,在标准切面上测量各参数值,对照李胜利的《胎儿畸形产前超声诊断学》[1],股骨长度(FL)小于相同孕周2倍标准差以上诊断为股骨短小,并计算FL/AC(腹围),TC(胸围)/AC以及心胸比值。如果发现疑似异常部位且成像质量较差,采用三维成像进行观察。如果胎儿的四肢无法清晰观察,建议孕妇活动30 min后复检。

高通量测序:对怀疑胎儿肢体短小的孕妇,抽取其外周血,提取血浆游离DNA,进行全外显子测序,若筛查出致病基因突变,孕妇要求引产,于引产2 d后再采用Sanger测序技术检测其父母相同位点是否存在突变。将以上检测结果与正常分娩后胎儿脐血基因检测,引产后的胎儿进行X线检查及基因检测(方法参照本团队前期研究[6]),进一步验证。全部检测在经过孕妇及家属知情同意下进行。

2 结果

2.1 超声检测结果

超声共计检测10例胎儿四肢短小者,其中股骨长度小于相同孕周2-3倍标准差5例,小于3-4倍标准差2例,小于8倍标准差3例。病例编号4和10的孕妇孕2产1,病例编号4的孕妇第1胎无明显异常,病例编号10的孕妇第1胎引产后经胎儿组织基因检测证实为致死性侏儒,超声表现与此胎相似。10例病例各测量参数值见表1。病例编号8的胎儿超声图像见图1,病例编号9,10与之类似。

表110例研究对象临床资料及超声参数值

Table1Clinicalandsonographicdataof10cases

序号孕周 BPDHCACTCFLHLFL/ACTC/AC长骨低于标准差1297.025.824.822.34.64.20.180.902-3SD226+16.525.022.422.24.64.30.250.992-3SD3357.225.719.719.14.54.20.230.972-3SD432+26.022.018.918.04.33.90.230.952-3SD5337.928.026.024.45.74.90.220.942-3SD6307.527.124.824.05.14.20.200.973-4SD729+37.427.724.223.04.54.10.190.953-4SD8257.224.019.716.22.01.80.100.82 >8SD923+16.823.119.415.52.01.80.100.80 >8SD1025+26.423.817.421.22.72.70.130.82 >8SD

BPD:双顶径;HC:头围;AC:腹围;FL:股骨长;HL:肱骨长

2.2 高通量测序结果

10例孕妇均进行了外周血全外显子测序,其中病例编号1-5的5例胎儿均未检测出明显致病性突变,病例编号6检测出COL1A1 c.932突变(G-T),病例编号7检测出COL1A2 c.2962突变(G-T),病例编号8-10检测出7R248c突变(C-T),结果见表2,基因检测结果见图2-4。

2.3 妊娠结局

病例编号1-5的5例孕妇部分早产分娩、产后随访,胎儿外观及四肢未见明显异常,病例编号3,4,5胎儿出生时体质量均小于2 500 kg。病例编号6,7的胎儿引产后外观未见明显异常,X线平片见骨皮质毛糙,长骨略弯曲。病例编号8,9,10引产后X线片结果提示:长骨严重短粗、“电话接收器”状股骨和肱骨、干骺端边缘不光整、鱼嘴状坐骨切迹;胸廓狭小、双侧肋骨近端细小,远端膨大呈杯口状;椎体扁平,椎间盘间隙增宽(见图5)。

A.长度短小、弯曲,呈“电话接收器”状;B.胸腔狭小;C.长度短小三维图像;D.胸腔狭小三维图像图1 病例编号8胎儿的超声图像Figure 1 The sonographic features of case 8

表210例胎儿短肢畸形高通量测序结果及诊断

Table2Thehighthroughputsequencingresultsandthediagnosisof10casesoffetalshortlimbmalformation

序号 高通量测序结果 随访或引产结果1未检测出明显致病性突变父身高1.70 m,母身高1.51 m,胎儿正常2未检测出明显致病性突变父身高1.68 m,母身高1.49 m,胎儿正常3未检测出明显致病性突变IUGR,胎盘老化4未检测出明显致病性突变IUGR,帆状胎盘5未检测出明显致病性突变IUGR6COL1A1 c.932突变(G-T)24周引产,成骨发育不全7COL1A2 c.2962突变(G-T)22周引产,成骨发育不全87R248c突变(C-T)22周引产:致死性侏儒97R248c突变(C-T)23周引产:致死性侏儒107R248c突变(C-T)25周引产:致死性侏儒

3 讨论

胎儿短肢畸形是临床常见的出生缺陷之一,包括成骨发育不全、软骨发育不全、致死性侏儒、短肋-多指综合征等[7]。目前常见的胎儿短肢畸形的致病基因已经明确,如软骨发育不全、致死性侏儒致病基因为FGFR3基因,成骨发育不全致病基因为COL1A1/COL1A12[8,9]。对于骨发育不良的超声诊断,主要是在孕中晚期进行,超声特征不典型的病例,很难明确诊断及分型。为了避免误诊及漏诊,同时考虑基因突变的复杂性,本研究中对超声诊断的10例短肢畸形胎儿均进行了胎儿基因全外显子的测序,完成了产前准确的基因诊断。

图2 病例编号6基因检测结果:COL1A1 C.932突变(G-T)Figure 2 The results of high throughput sequencing for case 6 revealed a mutation of COL1A1, c.932G>T(p.G311V)

图3 病例编号7基因检测结果:COL1A2 c.2962突变(G-T)Figure 3 The results of high throughput sequencing for case7 revealed a mutation of COL1A2, c.2962G>T(p.G988V)

图4 病例编号8基因检测结果为7R248c突变(C-T)Figure 4 The results of high throughput sequencing for case8 revealed a mutation of FGFR3, c.742C>T(p.R248C)

A.正位 B.侧位图5 病例编号8引产胎儿X线结果Figure 5 Postnatal X-ray of case 8

当长骨长度低于正常孕周平均值的2-4倍标准差时,若无相关基因异常,同时胎儿生长速度维持在一定水平,多考虑为胎儿生长受限或正常胎儿。胎儿生长受限均可通过给予早期干预,减少临床围生期胎儿死亡率[10,11]。本研究中5例胎儿长骨长度低于正常孕周平均值2-3倍标准差,均未检测出明显致病性突变,跟踪随访胎儿未见明确异常,其中病例编号1、2胎儿四肢短小原因考虑存在胎儿父母身高偏矮的遗传因素,病例编号3-5出生时胎儿体重均小于2 500 kg,结合超声所见多考虑为IUGR,其中病例编号3,4致病因素明确。本研究中病例编号6,7胎儿长骨长度低于正常孕周平均值3-4倍标准差,经基因检测分别为COL1A1 c.932突变(G-T)及COL1A2 c.2962突变(G-T),与美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)指南[12]比对,分别提示突变为Ⅲ型、Ⅲ/Ⅳ型成骨发育不全的致病基因突变,目前未见该突变位点的相关文献病例报道。

当长骨长度低于正常孕周平均值的4倍标准差时,往往提示预后不良[13],目前致死性骨发育不良的主要超声特征为:①严重的四肢短小畸形,四肢所有长骨长度<正常孕周平均值的4倍标准差,FL/AC<0.16;②严重的胸部发育不良,排除心脏畸形时TC低于正常孕周平均值的第五百分位数,心胸比值>60%,TC/AC<0.89[1]。本研究中病例编号8,9,10的胎儿产前超声符合以上诊断标准,经基因检测为FGFR3 7R248c突变(C-T)基因突变,该位点为Ⅰ型致死性侏儒的常见突变位点,引产后X线也进一步得到验证[14]。

综上所述,本次研究可证实,在超声筛查胎儿短肢畸形的初诊基础上,采用产前基因诊断可以明确胎儿短肢畸形发病原因,进而达到确诊及分型,为优生优育提高可靠的参考信息,为患病家庭提供准确的遗传咨询,临床价值显著,值得关注并推广。

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