血清miR-21-5p在子宫内膜样腺癌中的表达及意义

蔡如玉,张金玲,唐丹燕,马利国,邵 丹,李明娥

(暨南大学第二临床医学院,深圳市人民医院妇科,深圳 518020;*

子宫内膜癌的发病率近年来呈明显上升趋势[1],其中子宫内膜样腺癌(endometrioid endometrial carcinoma,EEC)占70%-80%。目前EEC发病机制尚不明确,缺乏有效的筛查及早期诊断的方法。miR-21是血清中检测出的第一个循环miRNA[2],在肿瘤学的研究中最为广泛、深入。其在乳腺癌、胃癌、结肠癌等多种实体肿瘤中表达异常[3,4]。Torres等[5]于2011年首次报道miR-21在子宫内膜癌组织中的表达较正常对照明显上调。测定子宫内膜癌患者血清中miR-21-5p的表达,目前国内未见相关报道。基于此,本研究采用qRT-PCR方法检测治疗前后miR-21-5p在子宫内膜样腺癌患者血清中的表达,初步探讨其在子宫内膜癌发病过程中的表达情况及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016-01～2016-12于深圳市人民医院妇科住院经手术治疗及病理确诊为子宫内膜样腺癌的患者35例,年龄34-73岁,平均(56.12±9.26)岁;所有患者均行手术病理分期(筋膜外全子宫切除或广泛全子宫切除+双附件切除+盆腔淋巴结切除术+/-腹主动脉旁淋巴结切除术)。对照组选取同期因异常子宫出血在我院行宫腔镜检查及诊刮术,病理排除子宫内膜病变的患者30例,年龄35-75岁,平均(44.35±8.66)岁。两组间年龄差异无统计学意义(P=0.153);两组入选病例均要求无合并其他类型肿瘤,无合并肝、肾方面疾病、糖尿病;术前未进行任何治疗。

1.2 试剂

miRNA cDNA Synthesis Kit、miRNA Purification Kit和miRNA qPCR Assay Kit均购自北京康为世纪生物技术公司。我们实验检测了血清中miR-21-5p和miR-21-3p,结果发现标本中只能检测到miR-21-5p。我们实验筛选了miR-16、miR-26a、miR-99a、miR-103、miR-221、let-7a共6个候选的内参基因,结果发现表达最稳定的是miR-221-3p,故选取内参miR-221-3p:5′-AGC TAC ATT GTC TGC TGG GTT TC-3′,miR-21-5p:5′-TAG CTT ATC AGA CTG ATG TTG A-3′。

1.3 研究方法

1.3.1 small RNA的提取 血样标本采集于患者手术前1周内,子宫内膜癌组于术后1周再次采集标本。所有患者在清晨空腹时于肘静脉采集全血5 ml,室温静置1 h后离心取上清(3 000 r/min),冻存于-80 ℃冰箱待检测。为获得更高浓度的small RNA,每份血清吸取600 μl转移到洁净EP管内,进行冷冻干燥处理。然后根据miRNA提取试剂盒(miRNA cDNA Synthesis Kit)说明书操作进行small RNA的提取。总RNA提取完毕后用超微量分光光度计Nano2000(美国Nanodrop公司)检测浓度和纯度,所检测标本的纯度(A260/A280)均在1.8-2.0之间,表明核酸纯度良好。

1.3.2 逆转录 根据逆转录试剂盒(miRNA cDNA Synthesis Kit)说明书分两步进行,第一步miRNA加Poly(A)尾,反应体系为25 μl,包括total small RNA 10 μl、10×Poly(A) Polymerase Buffer 2.5 μl、ATP 1 μl、E.coli Poly(A) Polymerase 0.5 μl和RNase-Free Water 11 μl,反应条件37 ℃,15 min。第二步cDNA第一链合成,反应体系20 μl,包括Poly(A)反应液4 μl、UltraPure dNTP Mix (10 mmol/L)1 μl、RT Primer (25 μmol/L)3 μl、5×SuperRT Buffer 4 μl、SuperRT 0.5 μl、RNase-Free Water 7.5 μl。反应条件42 ℃,50 min。

1.3.3 qRT-PCR检测 根据qPCR试剂盒(miRNA qPCR Assay Kit)说明书进行,所用仪器为Vii 7型号实时荧光定量PCR仪(美国life technologies公司)。反应体系为2×miRNA qPCR Mixture 5 μl、Forward primer(10 μmol/L) 0.2 μl、Reverse primer(10 μmol/L)0.2 μl、miRNA第一链cDNA 1 μl和ddH2O 3.6 μl。反应条件为预变性95 ℃ 10 min,循环条件为95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,45个循环,溶解曲线分析60-95 ℃。所有标本均做3个复孔。求平均Ct值作为实验结果。得到miR-21-5p基因以及内参miR-221-3p的相对表达量,采用2-ΔΔCt进行统计分析。

1.4 统计学分析

应用SPSS 21.0统计软件处理数据,经正态分布检验,数据呈偏态分布,血清中miR-21-5p的相对表达量用平均秩表示,两组间比较均采用两个独立样本比较的Wilcoxon秩和检验(Mann-WhitneyUtest),P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-21-5p的qPCR检测结果

miR-21-5p扩增曲线呈现典型的S型曲线,基线平,拐点清楚,各样本间的扩增曲线平行性好,表明其扩增效率基本一致,扩增满意。溶解曲线呈现单一峰,无引物二聚体和非特异性扩增产生,产物单一。

2.2 子宫内膜样腺癌组术后与术前及正常对照血清miR-21-5p相对表达量比较

子宫内膜样腺癌术前血清中miR-21-5p相对表达量显著高于对照组(P<0.01)。子宫内膜样腺癌术后血清中miR-21-5p相对表达量与术前比较显著下降(P<0.05),与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。

2.3 miR-21-5p在不同临床和病理特征的子宫内膜样腺癌患者术前血清中的表达

年龄≤50岁子宫内膜样腺癌患者血清miR-21-5p相对表达量较年龄>50岁显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。肌层浸润深度≥1/2的患者血清miR-21-5p的相对表达量显著低于肌层浸润深度<1/2者(P<0.05)。有淋巴结转移的患者中的相对表达量显著低于无转移者(P<0.05,见表2)。

表1子宫内膜样腺癌组术前与术后、正常对照血清miR-21-5p相对表达量比较

Table1ComparisonoftheexpressionofserummiR-21-5pbetweenendometrioidendometrialcarcinomaandnormalcontrolbeforeandafteroperation

组别nmiR-21-5p相对表达量(平均秩)ZP癌症组术前3564.712.650.008a癌症组术后3538.633.480.001b对照组 3047.771.570.117c

a癌症组术前与对照组比较;b癌症组术前与术后比较;c癌症组术后与对照组比较

表2miR-21-5p在不同临床病理特征子宫内膜样腺癌的表达

Table2ExpressionofserummiR-21-5pinendometrioidendometrialcarcinomapatientswithdifferentclinical-pathologicalfeatures

临床和病理特征nmiR-21-5p相对表达量(平均秩)tP年龄3.95 0.000 ≤50岁1426.36 >50岁2112.43FIGO分期0.910.361 Ⅰ期2517.00 Ⅱ期及以上1020.50病理分级0.500.620 1级1718.88 2+3级1817.17淋巴结转移2.310.021 无3019.63 有58.20肌层浸润2.360.018 <1/22221.14 ≥1/21312.69

3 讨论

子宫内膜癌的发病过程复杂,伴随着表观遗传学的改变。微小RNA(miRNA)在转录后水平调节基因的表达,与肿瘤发生、发展、转移等密切相关。miRNA具有类似癌基因或抑癌基因的作用,在肿瘤组织表达增高或减低,并导致血液miRNA含量与正常人存在明确差异,且肿瘤miRNA异常表达具有组织特异性。在临床工作中,外周血的采集具有操作简单、创伤小、可重复等优点,且外周血miRNA稳定性强,能够反映机体的病理生理状态,因此,miRNA是潜在的新型肿瘤标志物。近期的研究表明多种miRNAs参与了子宫内膜癌的发生、发展及预后的调控,包括miR-10a[6]、miR-9[7]、miR-135a-5p等。

miR-21的编码基因位于17q23.2,于肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等恶性肿瘤中高表达,被公认为致癌性微小RNA,影响肿瘤的迁移和浸润能力,在肿瘤发生、发展的各个阶段均发挥着重要的作用[8]。Gao等[3]的研究结果表明,乳腺癌患者血清miR-21水平显著升高(约3.39倍);miR-21诊断乳腺癌的敏感性和特异性分别为87.6%和87.3%,而乳腺癌传统的血清肿瘤标志物CA153和CEA的敏感性分别为22.47%和15.73%。但miR-21与子宫内膜癌的关系研究甚少。

本研究结果显示,与正常对照比较,子宫内膜样腺癌患者血清miR-21-5p的表达显著升高,术后显著下降,且术后与正常对照比较差异无统计学意义,表明miR-21-5p可能作为癌基因参与了子宫内膜癌的发生。本研究还发现,年龄≤50岁子宫内膜样腺癌患者血清中其表达量明显高于年龄>50岁患者(P<0.05),肌层浸润深度≥1/2的患者中的相对表达量明显低于肌层浸润深度<1/2者(P<0.05)。Tsukamoto等[9]报道子宫内膜样腺癌早期(Ⅰa期Ⅰ级)患者血浆中miR-21的表达量显著高于进展期(>Ⅰa期Ⅰ级)患者,差异有统计学意义(P=0.017)。流行病学表明,子宫内膜癌的预后与年龄有关,年龄越大预后越差,有淋巴结转移及浸润深度超过1/2肌层者预后较差。本研究结果提示子宫内膜样腺癌患者血清miR-21-5P的表达水平与不良预后因素呈负相关,其具体原因及机制尚待进一步研究。相关研究已证实miR-21可通过调节靶基因PTEN的表达来影响子宫内膜癌的生物学行为[10],说明血清miR-21-5P检测不仅可用于子宫内膜癌的预后评估,还有望成为子宫内膜癌早期筛查、诊断的新指标。

综上所述,miR-21-5p在子宫内膜样腺癌患者血清中表达明显增加,但与部分不良预后因素呈负相关,结果提示,miR-21-5p可能在子宫内膜样腺癌的发生、发展过程中发挥重要作用,检测血清miR-21-5p的表达对子宫内膜样腺癌的临床诊断和治疗可能有重要的指导意义。

参考文献：

[1] Torre LA,Bray F,Siegel RL,etal.Global Cancer Satistic,2012[J].Ca A Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[2] Lawrie CH,Gal S,Dunlop HM,etal.Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma [J].Br J Haematol,2008,141(5):672-675.

[3] Gao J, Zhang Q, Xu J,etal.Clinical significance of serum miR-21 in breast cancer compared with CA153 and CEA[J].Cancer Res,2013,25(6):743-748.

[4] Wang B,Zhang Q.The expression and clinical significance of circulating microRNA-21 in serum of five solid tumors[J].Cancer Res Clin Oncol,2012,138(10):1659-1666.

[5] Torres A,Torres K,Paszkowski T,etal: Highly increased maspin expression corresponds with up-regulation of miR-21 in endometrial cancer: a preliminary report[J].Int J Gynecol Cancer,2011,21:8-14.

[6] 李学慧,张霞,齐丽宁,等.miR-10a在子宫内膜癌中的表达及意义[J].广东医学,2016,37(6):848-850.

[7] Torres A,Torres K,Pesci A,etal.Diagnostic and prognostic significance of miRNA signatures in tissues and plasma of endometrioid endometrial carcinoma patients[J].Cancer,2013,132(7):1633-1645.

[8] Park HK,Jo W,Choi HJ,etal.Time-course changes in the expression levels of miR-122,-155,and-21 as markers of liver cell damage,inflamation,and regeneration in acetaminophen-induced liver injury in rats[J]. Vet Sci,2016,17(1):45-51.

[9] Tsukamoto O,Miura K,Mishima H,etal.Identification of endometrioid endometrial carcinoma-associated microRNAs in tissue and plasma [J].Gynecol Oncol,2014,132(3):715-721.

[10] Qin X,Yan L,Zhao X,etal.microRNA-21 overexpression contribute to cell proliferation by targeting PTEN in endometrioid endometrial cancer[J].Oncol Lett,2012,4(6):1290-1296.