云南泡核桃壳提取物体外抗肝纤维化活性研究

李春艳，陈进汝，董寿堂，刘 熙，郝芳芳，李冬梅，李丹丹

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；2.大理大学第一附属医院神经内科，云南大理 671000）

肝脏疾病包括慢性肝炎、酒精脂肪肝、肝纤维化、肝硬化和肝癌。肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理过程，其最终发展为肝硬化，更是肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）的前兆〔1〕。肝纤维化是肝脏细胞外基质（ECM，以胶原蛋白为主要成分）的合成与代谢失调的结果，导致肝内胶原过多或异常的胶原纤维沉积的病理状态及相关改变，引起肝内、外循环障碍，影响肝细胞与血液之间的物质交换〔2〕。在各种参与肝纤维化的细胞中，肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）的活化是肝纤维化发生的核心环节〔3〕，活化的HSC一方面合成分泌大量的胶原蛋白（胶原蛋白水解酶活性被抑制），导致ECM合成降解失衡而大量沉积于组织间隙中；另一方面，活化的HSC通过自分泌方式异常合成转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1），合成的TGF-β1又作用于邻近的HSC，启动HSC活化〔4-5〕。持续的HSC激活导致细胞表型发生改变，由原有的HSC转化为肌成纤维细胞而导致肝脏结构的重构，即肝纤维化病变〔6〕。故能抑制HSC增殖，减少Ⅰ型胶原（ColⅠ）、III型胶原（ColⅢ）的含量，可作为药物治疗肝纤维化的靶点，加之临床研究和实验证实，肝纤维化通过积极有效的治疗可以逆转，从而提高患者生存率和改善生活质量，但发展到肝硬化阶段则很难逆转。因此，防治肝纤维化是治疗的关键。

云南泡核桃主产于云南漾濞地区，为漾濞泡核桃（Juglans sigillata D.）系胡桃科（Juglandaceae）胡桃属（Juglans）植物的成熟果实。该核桃属植物具有抗肿瘤、消炎、镇痛〔7-11〕及抗氧化〔12-13〕等药理作用。研究发现，HSC活化、增殖及胶原合成与氧化应激引起的脂质过氧化有关〔14〕。如有文献报告，ROS能够导致HSC的活化增殖〔15〕。同时研究表明〔16〕脂质过氧化物3壬稀（HNE）能促使MAPK活化，提高PDGF受体结合活性，进而导致HSC的活化，促进肝纤维化。另外，持续的炎症也是导致肝纤维化的重要因素。因此具有抗炎抗氧化的药物对肝纤维化本身就有治疗效果。鉴于以上理论依据，加之未见相关研究报告云南泡核桃壳抗肝纤维化作用，故本文考察云南泡核桃壳对HSC增殖的影响，及其对正常人肝细胞（L-02）的毒性作用，以筛选出活性高、毒性小的抗肝纤维化提取物，在此基础上检测云南泡核桃壳提取物干预下HSC培养上清中TGF-β1、ColⅠ、ColⅢ的含量，初步探讨其抗肝纤维化的作用机制。

1 材料

1.1 云南漾濞泡核桃壳提取物及得率 本实验所用样品采于云南大理漾濞县，经大理大学生药教研室夏从龙教授鉴定为胡桃科（Juglandaceae）胡桃属（Juglans）植物云南泡核桃（Juglans sigillata D.）的成熟果实。HTK-D：醇提水沉后经碱提酸沉法得到的滤液，一倍醇溶后得到（得率为0.20%）；HTK-F：滤液两倍醇溶得到的滤液再五倍醇溶得到的沉淀HTK-F（得率为0.21%）；HTK-DEF：醇提水沉后经碱提酸沉法得到的滤液，一次五倍醇溶，过滤，得沉淀HTK-DEF（得率为0.70%）。

1.2 细胞株 HSC、L-02均购自中国科学院昆明动物研究所细胞库。

1.3 试剂与仪器 DMEM高糖培养基、胎牛血清、PBS均购自Gibco公司；0.25%胰蛋白酶（Thermo公司）；噻唑蓝（MTT）、Hepes、双抗（青霉素100 mg∕L，链霉素100 mg∕L）、二甲基亚砜（DMSO）均购自Sigma公司；秋水仙碱（西双版纳版纳药业有限公司，批号：07010）；TGF-β1检测试剂盒（欣博盛生物科技有限公司）；胶原检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；连续波长酶标仪（Bio-Tek）；Es-315高压灭菌器（日本Tomykogyo）；Yj-1450无菌操作台（苏州安泰空气技术有限公司）；微量移液器（Gilson）；IX-7倒置相差显微镜（Olympus）；水套式CO2细胞培养箱（Thermo公司）。

2 方法

2.1 细胞接种HSC用完全培养基 （含10%灭活FBS的DMEM）在37℃、5%CO2培养箱中培养，试验时取对数生长期细胞，0.25%胰酶消化、离心后，弃去上清液，完全培养基调细胞浓度至1×105个∕mL，100 μL∕孔接种于96孔板，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养12 h。

2.2 云南泡核桃壳提取物对HSC增殖的影响 将已培养HSC细胞12 h的培养板，弃去上清液，分别于每孔加入浓度梯度HTK-D、HTK-F、HTK-DEF样品溶液，终浓度为1 000.00、250.00、62.50、15.63、3.91、0.98 μg∕mL，每个浓度设3个复孔，同时设置阳性对照组（秋水仙碱）、阴性对照组和空白对照组。放置37 ℃、5%CO2培养箱中分别培养24、48、72 h后，弃去上清液，每孔加入20 μL MTT（5 mg∕mL）溶液，继续培养4 h后，加入150 μL∕孔DMSO溶液，紫色结晶溶解后，在波长490 nm处检测各孔OD值，按下式计算抑制率。

抑制率（%）=［1-（OD实验-OD空白）（∕OD阴性-OD空白）］×100%

2.3 云南泡核桃壳提取物对L-02细胞毒性实验

弃去已培养12 h的L-02细胞培养板上清液，待测样品的加入和对照同“2.2”。于37℃、5%CO2培养箱中分别培养24、48、72 h，弃去上清液，每孔加入5 mg∕mL MTT 20 μL，继续培养4 h，再加入DMSO溶液150 μL∕孔，待紫色结晶溶解后，在波长490 nm检测各孔OD值，按下式计算出存活率。

存活率（%）=（OD实验-OD空白）（∕OD阴性-OD空白）×100%

2.4 ELISA法检测TGF-β1含量 按试剂盒说明书操作。显色后，以空白孔调零，在波长490 nm处读取OD值。以OD值为纵坐标、标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据所测得的OD值在标准曲线上计算出云南泡核桃壳提取物上清中TGF-β1的相应浓度。

2.5 ELISA法检测ColⅠ、ColⅢ含量 按试剂盒说明书操作，设置标准品组、样品组（云南泡核桃壳提取物HTK-D、HTK-F、HTK-DEF）及空白组，显色后，以空白孔调零，在波长490 nm处读取OD值；以OD值为纵坐标、标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据所测得的OD值在标准曲线上计算出ColⅠ、ColⅢ含量的相应浓度。

2.6 统计学处理 实验数据均采用SPSS 18.0统计软件进行处理，数据以（xˉ±s）表示，各组间均数比较采用方差齐性检验后单因素方差分析，两两组间比较采用LSD-t比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 云南泡核桃壳提取物对HSC增殖的影响 肝纤维化发生的中心环节是HSC的激活，HSC的过度激活、增殖是肝纤维化形成的关键。故抑制HSC的增殖，是目前研发抗肝纤维化药物的靶点之一。从表1中实验结果可知：从24 h到48 h，随着云南泡核桃壳提取物与HSC作用时间的延长，云南泡核桃壳各提取物平行浓度下的抑制作用增强。与阴性对照组比较，24 h时，HTK-D、HTK-F分别在1 000.00、250.00 μg∕mL时对HSC增殖的抑制差异均具有统计学意义（P＜0.05），HTK-DEF仅在1 000.00 μg∕mL时对HSC增殖的抑制差异具有统计学意义（P＜0.05）；48 h时，HTK-D、HTK-DEF在15.63 μg∕mL至1 000.00 μg∕mL时抑制HSC增殖差异均具有统计学意义（P＜0.05），HTK-F对HSC增殖的抑制差异具有统计学意义的浓度范围为 62.5～1 000.00 μg∕mL。云南泡核桃壳各提取物与HSC孵育至72 h时，云南泡核桃壳提取物对HSC细胞增殖的抑制作用并不随时间延长而增强，由此可得出抑制HSC增殖作用较好的时间点为云南泡核桃壳各提取物与HSC细胞作用48 h。

表1 云南泡核桃壳提取物对HSC细胞增殖作用（xˉ±s，n=3）

3.2 云南泡核桃壳提取物对L-02细胞的毒性作用

由于体内实验中，针对靶细胞HSC治疗的抗肝纤维化药物不能有效地被摄取及无细胞选择性，可能影响其他组织器官正常的生理功能而引起无法预期的严重副作用，故实验中考察云南泡核桃壳提取物对L-02的毒性作用，以期筛选出活性高、毒性小的抗肝纤维化活性提取物。根据“3.1”得出的结果，云南泡核桃壳提取物与HSC细胞作用48 h时，抑制HSC增殖作用较好，故考察HTK-D、HTK-F、HTK-DEF分别与人正常细胞L-02细胞作用48 h后，对L-02细胞的毒性作用。从表2中的结果可知，云南泡核桃壳提取物HTK-D与L-02细胞作用48 h 后，在1 000.00 μg∕mL时，仍有50%以上的L-02细胞存活，其CC50＞1 000.00 μg∕mL。云南泡核桃壳提取物HTK-F、HTK-DEF对L-02细胞的CC50分别为354.73、457.09 μg∕mL。

表2 云南泡核桃壳提取物对L-02细胞的毒性作用（xˉ±s，n=3）

3.3 云南泡核桃壳提取物对TGF-β1的作用 在肝纤维化过程中，TGF-β被认为是一类重要的细胞生长调控因子，尤其是其亚型TGF-β1，被证实参与多种纤维化病变发生发展〔17〕。故在实验中考察云南泡核桃壳提取物对TGF-β1生成的影响。云南泡核桃壳各提取物与HSC细胞作用48 h后，收集上清，ELISA法检测其上清中TGF-β1的含量，与阴性对照组比较，HTK-D、HTK-F、HTK-DEF在 62.50、250.00、1 000.00 μg∕mL时均能降低HSC通过自分泌方式异常生成TGF-β1（P＜0.05），以1 000.00 μg∕mL时的作用较显著（P＜0.01）且呈浓度依赖性。见表3。

3.4 云南泡核桃壳提取物对I型胶原、III型胶原的作用 活化的HSC细胞合成分泌大量的胶原蛋白，导致细胞外基质合成降解失衡而大量沉积于组织间隙中，实验中采用ELISA法检测云南泡核桃壳提取物与HSC作用48 h后培养上清中Col I、Col III的含量。从表4中数据可知，与阴性对照组比较，HTK-D、HTK-F、HTK-DEF分别在各浓度梯度下均能减少Col I、Col III的生成（P＜0.05，P＜0.01），且均呈浓度依赖性。

4 讨论

我国慢性肝炎患者数千万，是病毒性肝炎流行高发区，加上某些有毒物质或药源性所致的肝损伤，都有可能发生肝纤维化。目前学者普遍认为，肝脏疾病的发生发展模式为急性→慢性→肝纤维化→肝硬化→肝癌，肝硬化为不可逆阶段，而肝纤维化为一动态过程，属可逆病变〔6，18〕，故寻找高效的抗肝纤维化药物，阻断肝纤维化向肝细胞癌恶性演变，是治疗各种肝病的根本目标。肝纤维化是继发于各种原因引起的肝脏炎症或损伤后组织修复过程中的代偿反应，以肝脏ECM过度沉积及分布异常为病理特征〔19〕。在肝纤维化过程中，调控肝脏ECM沉积的重要细胞是HSC，且HSC细胞的过度激活、增殖是肝纤维化形成的关键。从实验结果可知：48 h时云南泡核桃壳提取物HTK-D、HTK-F、HTK-DEF均能抑制HSC的增殖，HTK-D、HTK-F在1 000.00 μg∕mL下抑制HSC增殖的抑制率分别为（60.28±0.01）%、（67.37±0.01）%，提示醇提水沉后经碱提酸沉法得到的滤液，一倍醇溶后得到HTK-D、滤液两倍醇溶得到的滤液再五倍醇溶得到的沉淀HTK-F并不随着醇溶倍数的增加而使得活性成分的含量降低而影响其抑制HSC增殖的作用，改变提取工艺经醇提水沉后经碱提酸沉法得到的滤液，一次五倍醇溶，过滤，得沉淀HTK-DEF，在1 000.00 μg∕mL时对HSC增殖的抑制率为（59.02±0.01）%，与HTK-D、HTK-F在1 000.00 μg∕mL的抑制率相差不大，差异无统计学意义。同时提示云南泡核桃壳提取物不同提取工艺得到HTK-D、HTK-F、HTK-DEF中均含有抑制HSC细胞增殖的活性成分。在此基础上，实验还考察云南泡核桃壳提取物对正常人肝细胞的毒性作用，以筛选出活性高、毒性小的抗肝纤维化提取物。在云南漾濞泡核桃壳提取物中，HTK-D对L-02细胞毒性小，CC50＞1 000.00 μg∕mL，而HTK-F、HTK-DEF均对L-02细胞有一定的毒性作用，其CC50分别为354.73、457.09 μg∕mL。可知，云南泡核桃壳提取工艺不同影响其毒性作用的大小。

表3 48 h云南泡核桃壳提取物对TGF-β1的抑制作用（xˉ±s，n=3）

表4 48 h云南泡核桃壳提取物对ColⅠ、ColⅢ的影响（xˉ±s，n=3）

TGF-β1可激活HSC合成ECM，抑制肝细胞再生，诱导肝细胞凋亡，同时激活更多的HSC细胞，进一步促进肝纤维化的进程，降低TGF-β1表达和生成，对缓解肝纤维化形成有着重要意义。实验中收集云南泡核桃壳各提取物与HSC细胞作用48 h后的培养上清，采用ELISA法检测其上清中TGF-β1的含量，实验结果显示HTK-D、HTK-F、HTK-DEF在62.50～1 000.00 μg∕mL均能抑制HSC细胞生成TGF-β1（P＜0.05）且呈浓度依赖性。采用LSD-t统计分析，得知HTK-D、HTK-F、HTK-DEF之间对抑制HSC生成TGF-β1差异无统计学意义，提示云南泡核桃壳提取工艺不同对抑制HSC生成TGF-β1无影响。

在肝纤维化过程中，活化的HSC细胞除通过自分泌方式异常合成TGF-β1外，还合成分泌大量的胶原蛋白，而胶原蛋白水解酶活性被抑制，导致ECM合成增多，降解减少，进而大量沉积于组织间隙中。而肝脏中的ColⅠ、ColⅢ则由HSC细胞合成。故在实验中考察云南泡核桃壳提取物对胶原生成的抑制作用，在HTK-D、HTK-F、HTK-DEF与HSC作用48 h后，收集培养上清用ELISA法检测ColⅠ、ColⅢ的含量。由实验结果可知：HTK-D、HTK-F、HTK-DEF在各浓度梯度下均能减少ColⅠ、ColⅢ的生成（P＜0.05，P＜0.01），且均呈浓度依赖性。采用LSD-t统计分析，HTK-D、HTK-F、HTK-DEF对抑制HSC生成ColⅠ差异无统计学意义，但对抑制HSC生成ColⅢ差异有统计学意义，提示云南泡核桃壳提取工艺不同对抑制HSC生成ColⅠ无影响，但对抑制HSC细胞生成ColⅢ有影响，抑制ColⅢ生成作用较好的提取工艺为经醇提水沉后经碱提酸沉法得到的滤液，一次五倍醇溶，过滤，得到的沉淀HTKDEF，其次为HTK-F的提取工艺，最后为HTK-D的提取工艺。

综上所述，云南泡核桃壳提取物HTK-D、HTK-F、HTK-DEF具有抑制HSC细胞增殖的作用，且HTKD对L-02细胞毒性小。云南泡核桃壳3个提取物物均具有抑制HSC细胞增殖作用，其作用机制可能与减少TGF-β1、ColⅠ、ColⅢ的生成作用有关。云南泡核桃壳较好的抗肝纤维化活性部位为醇提水沉经碱提酸沉法后一倍醇溶得到的沉淀即HTK-D。

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