基于HPLC波长切换法对芪归通便合剂中六种成分的含量测定

陶 健

0 引言

芪归通便合剂是我院的医院制剂，由炙黄芪、酒肉苁蓉、白术、升麻等十味中药材提取加工而成。方中黄芪、白术补肺健脾，当归补血活血为君药；肉桂温通血脉，肉苁蓉、制首乌滋补肝肾、调和气血、润肠通便为臣药；佐以炒决明子、炒火麻仁润肠通便，升麻、陈皮调理气机、健脾通便。诸药合用，共奏益气养血、滋补肝肾、润肠通便的功效。中药复方制剂成分复杂，单一成分难以控制产品质量的稳定性和均一性，为确保产品批次间的稳定和临床用药的安全有效，本文采用HPLC波长切换法对芪归通便合剂中主药黄芪所含主要成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素，白术所含主要成分白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ，酒肉苁蓉所含主要成分松果菊苷和毛蕊花糖苷进行同时测定研究，填补了芪归通便合剂质量标准在高效液相色谱法研究的空白。

1 仪器与试药

HP-1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；AB104-N型电子天平(南京庚辰科学仪器有限公司)。芪归通便合剂来源于平顶山市中医医院(每瓶装500 mL，批号：20161216、20170120、20170216、20170307、20170401、20170426、20170509、20170529、20170612、20170627)；松果菊苷对照品(82854-37-3)来源于上海纯优生物科技有限公司；毛蕊花糖苷对照品(111530-201512)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(111920-201606)、芒柄花素对照品(111703-201504)、白术内酯Ⅲ对照品(111978-201501)和白术内酯Ⅰ对照品(111975-201501)均来源于中国食品药品检定研究院；甲醇和乙腈为色谱纯，甲酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；进样量为10 μL；流动相A：甲醇-乙腈(1∶1)，流动相B：0.1%甲酸溶液，梯度洗脱(0～10 min，23.0%A；10～18 min，23.0%A→30.0%A；18～27 min，30.0%A→42.0%A；27～35 min，42.0%A→65.0%A；35～40 min，65.0%A→23.0%A)；0～18 min时在330 nm[1-2]波长下检测松果菊苷和毛蕊花糖苷，18～27 min在254 nm[3]波长下检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素，27～40 min在220 nm[4-5]波长下检测白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ。在此系统条件下，理论塔板数按所测色谱峰计均不低于3 500，分离度大于1.5。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取对照品松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ各适量，分别用甲醇溶解并制成单一成分的对照品储备液(各成分质量浓度分别为松果菊苷2.418 mg/mL、毛蕊花糖苷1.102 mg/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.510 mg/mL、芒柄花素0.788 mg/mL、白术内酯Ⅲ 0.416 mg/mL、白术内酯Ⅰ 0.382 mg/mL)；依次精密吸取对照品储备液松果菊苷2.5 mL、毛蕊花糖苷2.5 mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷1.0 mL、芒柄花素2.5 mL、白术内酯Ⅲ 2.5 mL、白术内酯Ⅰ 2.5 mL，置同一50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成测定用混合对照品溶液(所测各成分质量浓度分别为松果菊苷0.120 9 mg/mL、毛蕊花糖苷0.055 1 mg/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.010 2 mg/mL、芒柄花素0.039 4 mg/mL、白术内酯Ⅲ 0.020 8 mg/mL、白术内酯Ⅰ 0.019 1 mg/mL)。

2.2.2 供试品溶液和阴性对照溶液的制备 精密吸取芪归通便合剂3.0 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为芪归通便合剂供试品溶液。依据芪归通便合剂处方和制备工艺，分别制备不含炙黄芪的阴性样品、不含酒肉苁蓉的阴性样品和不含白术的阴性样品，再按照芪归通便合剂供试品溶液制备方法，分别制成黄芪阴性对照溶液、肉苁蓉阴性对照溶液和白术阴性对照溶液。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系考察 分别精密吸取松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ对照品储备液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于6个20 mL容量瓶中，分别用甲醇稀释至刻度，制成6个浓度梯度的混合对照品溶液，依法进样测定，以质量浓度C为横坐标，松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ的峰面积A为纵坐标进行线性回归，回归方程、线性范围和相关系数结果见表1。

2.3.2 专属性实验 分别精密吸取黄芪阴性对照溶液、肉苁蓉阴性对照溶液、白术阴性对照溶液、混合对照品溶液和芪归通便合剂供试品溶液各适量，依法进样测定，结果表明，松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ相互测定均无干扰，且阴性对6个成分的测定无干扰，色谱图见图1。

表1 6个成分的回归方程和线性范围

图1 混合对照品(A)、芪归通便合剂(B)、肉苁蓉阴性(C)、黄芪阴性(D)、白术阴性(E)色谱图

2.3.3 精密度试验 取混合对照品溶液，重复进样6次，记录松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ的峰面积，结果所测6个组分峰面积的RSD依次为0.95%、1.08%、1.36%、1.03%、0.79%、1.45%。

2.3.4 重复性试验 取芪归通便合剂(批号：20161216)6份，按照供试品溶液制备过程分别制成重复性试验供试品溶液，依法进样检测，分别计算松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ的含量，并计算所测6个组分含量的RSD，结果所测6个组分含量的RSD依次为1.22%、0.37%、1.79%、0.53%、1.34%、1.65%。

2.3.5 加样回收试验 取已知含量的芪归通便合剂(批号：20161216)适量，精密吸取9份，每份1.5 mL，分别置25 mL量瓶中，依据中国药典2015年版四部《药品质量标准分析方法验证指导原则》，分别加入0.834 mg/mL松果菊苷对照品溶液1.0 mL 3份、2.0 mL 3份、3.0 mL 3份，0.387 mg/mL毛蕊花糖苷对照品溶液1.0 mL 3份、2.0 mL 3份、3.0 mL 3份，0.132 mg/mL毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液0.5 mL 3份、1.0 mL 3份、1.5 mL 3份，0.421 mg/mL芒柄花素对照品溶液0.5 mL 3份、1.0 mL 3份、1.5 mL 3份，0.292 mg/mL白术内酯Ⅲ对照品溶液0.5 mL 3份、1.0 mL 3份、1.5 mL 3份，0.214 mg/mL白术内酯Ⅰ对照品溶液0.5 mL 3份、1.0 mL 3份、1.5 mL 3份，按照芪归通便合剂供试品溶液制备方法制成高、中、低3种浓度，每种浓度3份的加样回收样品溶液，依法进样检测，计算这6个组分的平均加样回收率及RSD值，结果见表2。

2.4 样品含量测定 取批号分别为20161216、20170120、20170216的芪归通便合剂，按“2.2.2”项下的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依法进样检测松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ的含量，结果见表3。

3 讨论

在流动相的选择时，本实验首先考察对比了甲醇-水体系[5]、乙腈-水体系、甲醇-乙腈(1∶1)与水体系[6]，结果甲醇-乙腈(1∶1)与水体系所测各成分的分离效果优于甲醇-水体系和乙腈-水体系，但所测成分松果菊苷、毛蕊花糖苷峰形欠佳，存在拖尾现象；在此基础上，对比考察了甲醇-乙腈(1∶1)与0.1%甲酸溶液体系[1-3]、甲醇-乙腈(1∶1)与0.2%磷酸溶液[4,7-8]、甲醇-乙腈(1∶1)与1%醋酸溶液体系[9-10]，以色谱峰基线的平稳情况、所测各成分的峰形和分离度为综合考察指标，最终确定采用甲醇-乙腈(1∶1)与0.2%磷酸溶液为流动相，同时对流动相的比例进行摸索，最终确定了采用“2.1”项下的色谱条件对芪归通便合剂中松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ进行同时测定。

表2 松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ回收率

表3 含量测定结果(n=3，mg/mL)

从试验结果来看，在相同的生产工艺和测定方法下，不同批次芪归通便合剂所含松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ存在一定的差异，可能与不同批次芪归通便合剂所用中药材中相关成分含量的差异有关，因此，建立芪归通便合剂中多成分同时测定方法，并对所用中药材制定符合该制剂的内控质量标准势在必行，从而有效保证芪归通便合剂质量的稳定性，确保临床用药的安全有效。根据10个批次芪归通便合剂所测各成分含量平均值的80%，暂定芪归通便合剂每1 mL含酒肉苁蓉以松果菊苷计不得少于0.85 mg，以毛蕊花糖苷计不得少于0.40 mg；含炙黄芪以毛蕊异黄酮葡萄糖苷计不得少于0.07 mg，以芒柄花素计不得少于0.23 mg；含白术以白术内酯Ⅲ计不得少于0.16 mg，以白术内酯Ⅰ计不得少于0.11 mg。本实验采用波长切换法同时测定芪归通便合剂中6种成分的含量，方法灵敏度高，检测操作方法简便，对控制芪归通便合剂产品质量的均一性和疗效一致性提供了理论基础及数据支持。

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