重组人干扰素α-2b脂质体的制备及其家兔体内药动学研究

杨 杰

0 引言

干扰素(Interferon,IFN)是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广谱的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用，是人体预防系统的重要组成部分[1-2]。根据其分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω 4种类型。α型干扰素根据结构的不同再分为α-1b、α-2a、α-2b，其中α-2b型干扰素是我国临床上使用较多的一种。目前，干扰素由于其抗病毒作用强，抗病毒谱广，在我国临床上已广泛应用于治疗各种病毒感染所致的疾病，其中以治疗病毒性肝炎的临床应用最多、用量最大。在我国，各型病毒性肝炎均存在，尤其以乙型肝炎感染率最高、危害最大。目前，应用干扰素治疗乙型肝炎非常重要。

临床已批准使用的干扰素剂型主要有注射用冻干粉针、溶液型注射剂等普通剂型。由于干扰素如其他类细胞因子一样，其体内、外稳定性差，进入体液后易被体内的酶系统破坏失活，体内生物半衰期短，同时，干扰素吸收后在体内分布于全身，缺乏靶向性，到达病灶部位的干扰素的量有限[3]。有报道，干扰素静脉注射后，前1 h半衰期仅为15 min。其后3 h为90 min，6 h时血清中已检测不到药物水平。因此，临床需大剂量、频繁给药，同时毒副作用、不良反应也随之增大[4]。

脂质体是由类脂质双分子组成的类似生物膜结构的封闭囊泡，是近年来研究较多的新型药物载体。脂质体作为蛋白多肽类药物的载体，具有提高药物体内稳定性、延缓药物释放、延长生物半衰期、提高生物利用度的作用[5]。因此，研究开发重组人干扰素α-2b脂质体注射剂，利用脂质体载体的特点，以期达到延长药物在体内的存留时间，提高肝靶向和疗效的目的，具有重要意义。本文制备了重组人干扰素α-2b脂质体，以溶液作为参比，考察重组人干扰素α-2b脂质体家兔肌肉注射给药体内药动学的变化。

1 仪器与材料

DG-5031酶联免疫检测仪(南京华东电子集团医疗装备有限公司)；TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂)；CSL120GXL超速离心机(日本 Hitachi koko co.,Ltd)；LS230 激光粒度分析仪(美国BECKMAN)。

重组人干扰素α-2b(北京斯诺尔生物技术有限公司提供)；人干扰素α定量酶联检测试剂盒(进口分装，北京东方试剂公司)；Triton X-100 (FARCO CHEMICAL SUPPLIES HONG KONG)；大豆磷脂(SPC,Lipiod GmbH，Ludwigshafen Germany)；胆固醇(Cholesterol,Chol，广州试剂公司，进口分装)；其余试剂为分析纯。

新西兰种白兔,雄性，体重2.0～3.0 kg，由沈阳市东陵区龙元养殖场提供，合格证号：SCXK(辽)2003-0013号。

2 方法

2.1 重组人干扰素α-2b脂质体的制备及表征 称取磷脂、胆固醇(摩尔比2∶1)组分溶解于乙醚中，用磷酸盐缓冲液配制含一定浓度的rhIFN α-2b溶液作为水相，加入白蛋白作为稳定剂，水相与有机相以一定比例混合，冰浴超声形成W/O乳剂，减压除去有机溶剂，氮气流继续吹干使形成胶态状，用磷酸盐缓冲液40 ℃水化，超声形成小单室脂质体,超滤后,过0.22 μm微孔滤膜，即得。采用超速离心法测定脂质体包封率。取干扰素脂质体样品适量，以水为分散介质，用LS230激光粒度分析仪(Beckman Coulter)测定脂质体的粒度及其粒度分布。

2.2 重组人干扰素α-2b脂质体与溶液剂家兔肌肉注射给药体内药动学

2.2.1 血浆样品处理方法 精密量取血浆样品200 μL，加入含0.3% Triton X-100的试剂盒样品稀释液，稀释至样品浓度在测定标准曲线范围内，采用 ELISA法测定药物浓度。

2.2.2 双抗体夹心ELISA法测定血浆重组人干扰素α-2b浓度 用抗人干扰素α (IFN-α)单抗体包被于酶标板上，每孔中加入标准品或待测样品100 μL，标准品和样品中的IFN-α与单抗体结合，加入酶标记的抗人IFN-α抗体，形成免疫复合物连接在板上，洗涤，去除过量结合物，再加入酶底物OPD，出现黄色，加入终止液硫酸，颜色变深，呈色与IFN-α抗体复合物结合物量成正比。在492 nm处测定的OD值与样品或标准品中的IFN-α呈正比。用标准曲线法计算测定样品浓度。

2.2.3 药动学实验方案 取家兔6只，随机分成2组，每组3只，其中实验组于左后腿部肌肉注射重组人干扰素α-2b脂质体(250万IU/kg),对照组于左后腿部肌肉注射重组人干扰素α-2b溶液(250万IU/kg),给药后实验组于0.8、1.2、2.17、3.33、4、6.25、8、12、24 h取血，对照组于0.5、1.4、2、3、4、6、8、12、24 h取血，置涂有肝素的离心管中，离心10 min(3 000 r/min),取出血浆，-80 ℃保存，待测。

2.3 数据处理 应用统计距法计算药动学参数，并通过t检验进行显著性分析。

3 结果

3.1 重组人干扰素α-2b脂质体的制备及表征 本文采用逆向蒸发法制备的重组人干扰素α-2b脂质体外观为半透明溶液，其药物包封率为84%，粒径130 μm(SD 1.146)，90%的粒子小于156 μm。

3.2 药动学研究 本文采用ELISA法测定血浆及组织中药物浓度，经过特异性、回收率、精密度等含量分析方法学验证，证明本法适用于家兔体内药动学研究，确定线性范围：32～2 000 pg/mL。

标准曲线方程：lgA=0.929 7 lgC-2.620 1，r2=0.980 6。

重组人干扰素α-2b脂质体及重组人干扰素α-2b溶液家兔肌肉注射体内血浆药物浓度-时间图见图1，利用统计法求算药动学参数，见表1。

结果表明，与溶液剂相比，重组人干扰素α-2b脂质体延缓了药物的吸收，达峰时间Tmax由1.42 h延长至2.27 h，而峰浓度类似(14 283.7 pg/mL vs.15 000.0 pg/mL)，体内平均滞留时间(MRT)分别为4.86 h和6.00 h，脂质体组体内滞留时间较溶液剂组延长。体内消除半衰期分别为4.13 h和4.17 h(P<0.01)。血药浓度曲线下面积(AUC0-∞)分别为73 902.7 pg/(mL·h)和103 323.3 pg/(mL·h)，脂质组AUC为溶液剂组的1.4倍，体内生物利用度显著提高(P<0.05)。

图1 家兔肌肉注射重组人干扰素α-2b脂质体及重组人干扰素α-2b溶液体内血浆药物浓度-时间曲线图

表1 家兔肌肉注射重组人干扰素α-2b脂质体及重组人干扰素α-2b溶液药动学参数

注：与重组人干扰素α-2b溶液组比较，*P<0.05,**P<0.01

4 讨论

已有文献报道，逆相蒸发法适用于包裹水溶性大分子生物活性物质，通过该方法可以获得药物包封率较高的脂质体，但逆向蒸发法需要使用有机溶剂与含有药物的水相性形成W/O，对于生物活性蛋白干扰素遇有机溶剂可能产生失活的问题。本文采用人血白蛋白作为活性稳定剂，其首先吸附在油水界面上，避免了药物的界面吸附和失活，起到了良好的稳定作用。

目前，蛋白多肽类药物的药动学研究方法有同位素示踪法、ELISA法和生物检定法。ELISA法检测药物浓度，具有简单、方便、快速、特异性强等优点，因此，本文采用ELISA法测定血浆及组织中药物浓度，经过特异性、回收率、精密度等含量分析方法学验证，证明本法适用于家兔体内药动学研究，确定线性范围：32～2 000 pg/mL。标准曲线方程：lgA=0.929 7 lgC-2.620 1，r2=0.980 6。

已有文献报道了重组人干扰素α-2b脂质体肌肉注射小鼠或大鼠的药动学过程，但家兔体内药动学鲜有报道。本文制备了稳定重组人干扰素α-2b脂质体，并对其家兔体内药动学进行了比较性研究，以期为重组人干扰素α-2b脂质体制剂的研究提供更加广泛的动物体内数据。

结果表明，与参比制剂溶液剂相比，脂质体显著改变了重组人干扰素α-2b家兔肌肉注射给药的体内药动学行为，使其吸收延长，达峰时间延长，体内平均滞留时间增加，AUC显著提高。脂质体可作为重组人干扰素α-2b的潜在给药系统。

参考文献：

[1] Kotredes KP,Gamero AM.Interferons as inducers of apoptosis in malignant cells [J] .J Interferon Cytokine Res,2013,33(4):162-170.

[2] Lasfar A,Zloza A,Cohen-Solal KA.IFN-lambda therapy:current status and future perspectives [J] .Drug Discov Today,2016,21(1):167-171.

[3] 王军志.生物技术药物研究开发和质量控制[M] .北京：科学出版社，2002:472-433.

[3] Garcia-Garcia I,Gonzalez-Delgado CA,Valenzuela-Silva C,et al.Bioequivalence of two recombinant interferon alpha-2b liquid formulations in healthy male volunteers [J] .Brugs R D,2004,5(5):271-280.

[4] 姚文兵，林碧蓉，沈子龙，等.聚乙二醇修饰干扰素α2b的体内药代动力学研究[J] .中国药科大学学报，2001，32(6)：457-461.

[5] Li H,Yang L,Cheng G,et al.Encapsulation,pharmacokinetics and tissue distribution of interferon α-2b liposomes after intramuscular injection to rats [J] .Arch Pharm Res,2011,34(6):941-948.