红景天苷通过激活AMPK/PI3K/Akt/eNOS途径减轻ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化

左晓利，黄红莹，孟祥毅

0 引言

动脉粥样硬化是多种心脑血管疾病的基础。内皮细胞损伤应答学说认为，动脉粥样硬化是机体对血管内皮细胞损伤的一种慢性反应[1]。血管内皮细胞损伤表现为内皮功能障碍和紊乱，继而引起氧化应激、脂质代谢异常、脂质物质积聚等一系列生理病理变化，从而促进动脉粥样硬化形成[2]。红景天苷(Salidroside，SAL)是从药用植物红景天中分离的苯乙醇类单一中药成分，是红景天的主要活性成分之一。研究表明，红景天苷能够激活DNA修复酶poly(ADP-核糖)、聚合酶(Parp-1)，并保护细胞免受氧化应激[3]。近年研究表明，红景天苷可以降低低密度脂蛋白受体缺陷小鼠的动脉粥样化斑块形成[4]，但其抗动脉粥样硬化作用的机制尚不完全清楚。本研究通过高脂肪饮食诱导ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化，探究红景天苷对ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化的影响，并初步探讨所涉及的相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物来源及药物 8周龄雄性ApoE(-/-)小鼠50只(体重18～22 g)购自北京生命科学研究所，动物许可证号：SYXK(京)2015-0002。高脂肪食物(含15%脂肪、0.15%胆固醇)由北京生命科学研究所提供。红景天苷(纯度>98%)购自中国药品生物制品检定所，批号：111575-200502。

1.2 动物分组及处理 随机选取10只小鼠作为正常饮食组(ND组)，接受标准饮食。另外40只小鼠接受高脂饮食(小鼠食物中含15%脂肪、0.15%胆固醇)，持续8周。造模完成后，将高脂饮食小鼠随机分成4组，每组10只：模型组(HFD组)、低剂量红景天苷处理组(L-SAL组)、高剂量红景天苷处理组(H-SAL)、AMPK激活剂组(AC组)。

根据参考文献[5]进行红景天苷剂量选择。L-SAL组和H-SAL组分别灌服红景天苷30、50 mg/kg，1次/d，连续给药8周。根据参考文献[6]，AC组腹腔注射AMPK激活剂A-769662(可直接使AMPK磷酸化) 30 mg/kg，1次/d，连续给药8周。ND组和HFD组给予等体积蒸馏水。

1.3 血糖和血清脂质分析 红景天苷治疗8周后，采用葡萄糖监测仪(Life Scan，加拿大)测量小鼠空腹血糖(FBG)水平。禁食12 h后，取小鼠尾静脉血2 mL，4 ℃ 3 500 r/min离心20 min，分离血清，-80 ℃储存。采用脂肪酸和脂质代谢试剂盒(美国Sigma-aldrich)测量血清总胆固醇(TC)、HDL-c、LDL-c和三酰甘油(TG)。

1.4 ApoE(-/-)小鼠主动脉内皮性舒张功能测定 红景天苷治疗8周后，每组随机选取4只小鼠进行内皮依赖性舒张功能测定。小鼠注射60 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，经腹部除毛、消毒后，剪开腹腔暴露脏器，经后腔静脉放血处死，于体视显微镜下取主动脉血管鞘及周围结缔组织，浸泡于Krebs液中，剪成若干段长约4 mm的主动脉血管环。将每只小鼠各取3段血管环连接至JH-2张力换能器，采用BL-420S生物信号采集系统记录血管张力变化作为基础值。将血管环置于HV-4离体恒温器官灌流系统的浴槽中，通入含5% CO2的O2，给予血管环0.5 g张力负荷，待血管环张力平衡后，加入10-6mmol/L去甲肾上腺素溶液进行预刺激，平衡后，依次加入10-9～10-4mmol/L氯化乙酰胆碱(ACh)，记录每一浓度下血管环张力变化，取3个血管环的平均张力，内皮依赖性舒张度=[(最大张力-各浓度点张力)/(最大张力-基础值)] ×100%。经37 ℃ Krebs液灌洗2次后，换为浓度为10-9～10-4mmol/L硝普钠(SNP)刺激血管环，非内皮依赖性血管舒张度=(SNP诱发的血管环张力-加入ACh后的张力)/SNP诱发的血管环张力×100%。

1.5 标本采集 实验结束后，剩余小鼠禁食12 h后，处死。取小鼠主动脉根部组织，一部分组织置于-80 ℃保存，用于蛋白免疫印迹检测。另一部分组织于4%多聚甲醛中固定，行苏丹Ⅳ染色，或经常规脱水、石蜡包埋后，行HE染色、Masson染色、免疫组织化学分析。

1.6 ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化病变分析 取经4%多聚甲醛固定的组织，用苏丹Ⅳ染色以确定病变面积。由Sony 3-CCD摄像机采集图像，并使用ImagePro图像分析软件(Media Cybernatic Inc.，美国)进行分析。以病变(红色)覆盖的总主动脉表面积的百分比表示动脉粥样硬化病变形成的程度。取石蜡包埋组织，用切片机(Microtome International，德国)连续切片(4 μm)，经苏木精-伊红(HE)染色和Masson染色，于显微镜下观察。使用Image-Pro 图像分析软件进行分析。

1.7 免疫组织化学分析 石蜡包埋组织连续切片(4 μm)后，经脱蜡、干燥后，于常温下保存，行抗p-AMPKα(Thr172)、抗p-PI3K、抗p-Akt、抗p-eNOS(Ser1177)免疫组织化学染色。DAB显色试剂盒购自上海基因科技有限公司，抗p-AMPKα(Thr172)、抗p-PI3K、抗p-Akt、抗p-eNOS(Ser1177)单克隆抗体购自Cell Signaling Technology。免疫组织化学阳性细胞计算方法如下：在光学显微镜下随机选择3个海马区域视野(放大倍数×400)，拍摄数字图像并进行染色，根据视野内的平均光密度值(MOD)进行计算。

1.8 蛋白免疫印迹分析 使用补充有PMSF(Riche)的RIPA蛋白提取试剂(Beyotime)从组织中提取蛋白质。4 ℃下12 000 r/min离心10 min，10% SDS-PAGE分离上清液，将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜(Sigma)上。将膜在PBS和5%脱脂乳中封闭1 h，并用抗p-AMPKα (Thr172)、抗AMPKα、抗p-PI3K、抗p-Akt、抗Akt、抗p-eNOS (Ser1177)、抗eNOS和内部对照GAPDH (Cell Signaling Technology)的特异性一抗与膜于4 ℃孵育过夜。将膜用HRP缀合的二抗(Cell Signaling Technology)在室温下孵育1 h。使用增强的化学发光检测试剂(Thermo Scientific，Waltham，MA)定量免疫复合物的量。使用Quantity One软件(Life Technologies)评估相对蛋白表达水平。

2 结果

2.1 红景天苷对ApoE(-/-)小鼠血脂及血糖的影响 四组小鼠FBG、HDL-c、TG水平差异均无统计学意义(P>0.05)。HFD组、L-SAL组、H-SAL组小鼠TC、LDL-c水平高于ND组(P<0.05)。AC组、L-SAL组、H-SAL组小鼠TC、LDL-c水平与HFD组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2 红景天苷对ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化的影响

2.2.1 苏丹Ⅳ染色 应用苏丹Ⅳ染色评估红景天苷对ApoE(-/-)小鼠主动脉病变程度的影响。与ND组相比，HFD组小鼠主动脉根部组织经苏丹Ⅳ染色为红色；与HFD组相比，AC组、L-SAL组和H-SAL组小鼠主动脉根部苏丹Ⅳ染色为红色区域的面积减少。以病变覆盖总主动脉表面积的百分比表示动脉粥样硬化病变形成的程度，与HFD组相比，AC组、L-SAL组和H-SAL组小鼠病变区面积均显著降低，且H-SAL组显著低于L-SAL组，差异均有统计学意义(P<0.05)。H-SAL组与AC组差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

图1 ApoE(-/-)小鼠主动脉根部病变面积(n=6)

注：*与ND组比较，P<0.05；#与HFD组比较，P<0.05；Δ与AC组比较，P<0.05；&与L-SAL组比较，P<0.05

表1 红景天苷对ApoE(-/-)小鼠血脂及血糖的影响

注：与ND组相比，*P<0.05

2.2.2 HE染色 应用HE染色评估红景天苷对ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块的影响。与ND组相比，HFD组小鼠HE染色可见主动脉根部内膜出现凸向管腔的粥样硬化斑块，管腔面积减少，斑块明显增加；与HFD组小鼠相比，AC组、L-SAL组和H-SAL组主动脉根部斑块明显减少。以动脉粥样硬化斑块占主动脉瓣面积的百分比表明动脉粥样硬化斑块面积，与HFD组相比，AC组、L-SAL组和H-SAL组小鼠斑块面积均缩小，且H-SAL组显著低于L-SAL组(P<0.05)。H-SAL组与AC组差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图2 ApoE(-/-)小鼠主动脉根部斑块面积(n=6)

注：*与ND组比较，P<0.05；#与HFD组比较，P<0.05；Δ与AC组比较，P<0.05；&与L-SAL组比较，P<0.05

2.2.3 Masson染色 应用Masson染色评估红景天苷对ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块内胶原的影响。与ND组比较，HFD小鼠主动脉根部病变部位Masson染色显示，胶原蓝色染色明显减少；与HFD组小鼠比较，AC组、L-SAL组、H-SAL组小鼠斑块内胶原蓝色染色明显增加。以蓝色阳性染色面积百分比表明斑块内胶原含量，与HFD组相比，AC组、L-SAL组、H-SAL组小鼠胶原含量显著增加，且H-SAL组显著高于L-SAL组，差异均有统计学意义(P<0.05)。H-SAL组与AC组差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

图3 ApoE(-/-)小鼠主动脉根部斑块内胶原含量 (n=6)

注：*与ND组比较，P<0.05；#与HFD组比较，P<0.05；Δ与AC组比较，P<0.05；&与L-SAL组比较，P<0.05

2.3 红景天苷对ApoE(-/-)小鼠主动脉血管内皮依赖性舒张功能的影响 与ND组比较，HFD组小鼠主动脉血管内皮依赖性舒张功能显著降低(P<0.05)；与HFD组比较，AC组、L-SAL组、H-SAL组小鼠内皮依赖性舒张功能均显著增加(P<0.05)；H-SAL组与AC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。五组小鼠间非内皮依赖性舒张功能差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

2.4 红景天苷对ApoE(-/-)小鼠主动脉中p-AMPKα、p-PI3K、p-Akt、p-eNOS蛋白表达的影响 各组组织中均显示p-AMPKα、p-PI3K、p-Akt、p-eNOS蛋白阳性表达。与ND组相比，HFD组p-AMPKα(Thr172)、p-PI3K、p-Akt、p-eNOS(Ser1177)MOD值均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与HFD组相比，AC组、L-SAL组、H-SAL组p-AMPKα(Thr172)、p-PI3K、p-Akt、p-eNOS(Ser1177)MOD值显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。H-SAL组与AC组差异无统计学意义(P>0.05)，见图5。

图4 ApoE(-/-)小鼠主动脉血管内皮依赖性舒张功能(n=4)

注：A.内皮依赖性舒张功能测定，B.非内皮依赖性舒张功能测定。*与ND组比较，P<0.05；#与HFD组比较，P<0.05；Δ与AC组比较，P<0.05；&与L-SAL组比较，P<0.05

图5 ApoE(-/-)小鼠主动脉中p-AMPKα、p-PI3K、p-Akt、p-eNOS蛋白表达(n=6)

2.5 红景天苷对ApoE(-/-)小鼠主动脉中AMPK/PI3K/Akt/eNOS信号转导途径的影响 与ND组比较，HFD组p-AMPKα(Thr172)、p-PI3K、p-Akt、p-eNOS(Ser1177)蛋白表达显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与HFD组比较，AC组、L-SAL组和H-SAL组p-AMPKα(Thr172)、p-PI3K、p-Akt、p-eNOS(Ser1177)蛋白表达显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。H-SAL组与AC组差异无统计学意义(P>0.05)，见图6。

图6 ApoE(-/-)小鼠主动脉AMPK、PI3K、Akt、eNOS磷酸化水平检测(n=6)

3 讨论

ApoE(-/-)小鼠是常用的研究动脉粥样硬化发生机制的动物模型。本研究选用8周龄雄性ApoE(-/-)小鼠，通过高脂饮食构建动脉粥样硬化模型，结果显示，与正常饮食小鼠相比，HFD组小鼠表现出动脉粥样硬化病变，主动脉根部内膜出现凸向管腔的粥样硬化斑块，且斑块内胶原明显减少，表明造模成功。

药理学研究证实，红景天苷对心血管系统、神经系统具有良好的保护作用，且具有抗氧化应激、抗炎、免疫调节等多种药理活性[7]。国内有关研究表明，红景天苷可以降低低密度脂蛋白受体缺陷小鼠的动脉粥样硬化斑块形成[8]。本研究发现，红景天苷能够改善高脂肪饮食ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化病变情况，使主动脉根部的粥样硬化斑块减少，且增加斑块内胶原含量，提示红景天苷对高脂饮食诱导的动脉粥样硬化有一定的治疗作用。然而，红景天苷对ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化治疗作用的相关机制尚不明确。

血管内皮损伤及功能紊乱是动脉粥样硬化发生发展过程的关键影响因素之一，主要表现为一氧化氮(NO)合成减少。NO在内皮生物学中起重要作用，参与多种内皮功能调节，包括血管舒张、细胞增殖、衰老和凋亡等[9]。本研究通过测定内皮依赖性舒张功能来评估内皮功能，结果发现，ND组和HFD组小鼠非内皮依赖性舒张功能差异无统计学意义，而内皮依赖性舒张功能差异有统计学意义，证实血管舒张反应差异是由内皮功能异常引起的。HFD组小鼠内皮依赖性舒张功能显著下降，然而，经红景天苷处理后，小鼠内皮依赖性舒张功能显著改善，提示红景天苷可能通过保护血管内皮功能来改善ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化。

内皮一氧化氮合酶(eNOS)是合成NO的关键酶，其活化能够促进内皮细胞分泌NO，NO进一步发挥舒张血管效应，从而对抗内皮功能失调。eNOS活性受eNOS-Ser1177和eNOS-Thr495磷酸化的影响[10]。腺苷-磷酸蛋白激酶(AMPK)是由α、β、γ亚基组成的异源三聚体丝氨酸/苏氨酸激酶，其级联活化能够增加细胞在应激状态下的保护作用[11]。已证实，在营养过度和肥胖模型中，AMPK信号通路的失调能够导致代谢紊乱，并促进内皮功能障碍的发展[12]。在心血管系统中，AMPK活化能够使eNOS Ser1177位点磷酸化，磷酸化的eNOS进一步与热休克蛋白(HSP)-90结合，增加eNOS含量，使NO释放增加，从而改善内皮功能[13-14]。有研究发现，在培养的内皮细胞中，AMPK激活通过Akt-eNOS和/或PI3K/Akt/eNOS刺激eNOS Ser1177位点磷酸化，促进NO产生[15]。上述研究表明，AMPK及其下游级联PI3K-Akt-eNOS在内皮功能中起重要调控作用。近年研究表明，高脂肪饮食能够减少内皮AMPK磷酸化，导致内皮功能障碍相关的PI3K-Akt-eNOS通路的下调[16]。本研究发现，HFD组ApoE(-/-)小鼠p-AMPKα(Thr172)、p-Akt、p-PI3Kα-110、p-eNOS(Ser1177)蛋白表达水平均显著降低，提示动脉硬化小鼠中AMPK/PI3K/Akt/eNOS信号级联的抑制。既往研究发现，红景天苷通过激活eNOS来缓解同型半胱氨酸诱导的内皮功能障碍[17]。与此一致，本研究发现，红景天苷能够活化Ser1177位点，增加eNOS的磷酸化。另外，本研究发现，红景天苷能够激活AMPKα(Thr172)、Akt、PI3Kα-110蛋白的磷酸化，且与AMPK激活剂A-769662作用效果一致。提示红景天苷能够促使动脉硬化小鼠中AMPK/PI3K/Akt/eNOS信号级联的激活。结合相关研究结果，推测红景天苷使动脉硬化ApoE(-/-)小鼠内皮AMPKα-Thr172的磷酸化水平增加，其下游级联的PI3K/Akt信号通路被激活，使eNOS(Ser1177)磷酸化水平增加，促进NO释放，从而缓解血管内皮功能障碍，改善ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化病变。

血脂异常与血管内皮损伤往往并存，也是引起动脉粥样硬化的主要原因之一[18]，血清TC和LDL-c升高是动脉硬化的危险因素之一[19-20]。本研究发现，HFD组小鼠血清TC和LDL-c水平显著增加，提示血脂异常可能参与高脂饮食诱导的ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化过程。红景天苷处理虽然改善了小鼠动脉粥样硬化，然而对动脉粥样硬化ApoE(-/-)小鼠血清TC和LDL-c水平无明显影响，表明红景天苷对ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化的影响与血脂水平的改变无明显关系。

综上所述，红景天苷能够通过激活AMPK/PI3K/Akt/eNOS信号级联，改善与eNOS活化相关的血管内皮功能，从而减轻ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化病变。

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