参茸益精片对高脂血症大鼠的影响及分子机制研究

王自勤，王海伟，苏 丹，霍 坚，吕宏迪*

0 引言

近年来，高脂血症(Hyperlipidemia)临床发病率持续增高，对人类身体健康危害严重。高脂血症主要引起血胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白升高或高密度脂蛋白降低，其发生的分子机制复杂，影响因素众多，遗传基因和外界环境均会产生显著的影响，是一种体内脂类物质代谢紊乱所引起的全身慢性疾病[1-2]。高血压、糖尿病、胰岛素抵抗等代谢异常性疾病与高脂血症的发病密切相关[3-4]。阐明高脂血症发生、发展的分子机制，探寻有效的临床治疗靶点和预防治疗方案，是目前本领域国内外研究的热点。

参茸益精片主要由西洋参、黄芪等14味中药组成，具有复脉固脱、补脾益肝、生津养血、安神益智壮肾阳、益精血、强筋骨等功能，可用于丙肝、乙肝常规治疗后以及肿瘤患者放化疗后白细胞减少、血红蛋白低、高原反应及消化不良等症[5-7]。但参茸益精片是否可以影响高脂血症的临床症状，其具体分子机制如何，目前尚未见相关报道。本实验以大鼠高脂血症动物模型为研究对象，通过Western blot和RT-PCR等实验，观察低密度脂蛋白受体(LDLR)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、VEGF蛋白和mRNA表达的变化，分析并阐明参茸益精片影响高脂血症的分子机制，为其临床应用提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 建立高脂血症大鼠动物模型 SD大鼠(180～200 g)由一五九医院实验动物中心提供，随机分为空白对照组(对照组)、高脂血症模型组(模型组)、洛伐他汀治疗组(洛伐他汀组，0.1 mg/kg)，参茸益精片治疗组(低剂量组：0.1 mg/kg；中剂量组：0.5 mg/kg；高剂量组：1 mg/kg)，每组6只。模型组动物连续饲喂高脂饲料(20%蛋白粉，30%黄油，50%基础饲料)，自由饮水，4周后检测大鼠血脂水平[8]。治疗组在饲喂高脂饲料的同时，口服灌胃不同剂量的参茸益精片，洛伐他汀作为阳性对照组，4周后检测大鼠血脂水平和相关指标。

1.2 血脂水平分析 大鼠尾静脉采血，按照试剂盒说明，分析血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。

1.3 肝脏SOD和MDA活性分析 取大鼠肝脏，组织匀浆，2 000 r/min离心10 min，取上清，按照试剂盒说明，分析肝脏SOD和MDA的活性。

1.4 Western blot分析 分别取大鼠肝脏和主动脉组织，PBS冲洗，加入裂解液，机械匀浆处理，12 000 r/min离心30 min。BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜，5%奶粉孵育1 h，封闭非特异性背景染色，再分别加入LDLR、VCAM-1和VEGF一抗(1∶1 000)孵育，4 ℃过夜后，与二抗室温孵育2 h。ECL发光试剂盒发光显影，收集图像。

1.5 RT-PCR分析 分别取大鼠肝脏和主动脉组织，TRIZOL法提取总RNA，通过RT-PCR分析LDLR、VCAM-1和VEGF mRNA水平的变化。LDLR上游引物5′-GTGGTCTCGGCCCATCCA TCCCTGC-3′,下游引物5′-TGCGGCCACTCATCCGAGCCATCTT-3′；VCAM-1上游引物5′-ATCCCTACCATTGA AGATACTGG-3′，下游引物5′-TGATGACAGTTCTCCTTCTTTG-3′；VEGF上游引物5′-ATGGCAGAAGGAGGAGGG-3′,下游引物5′-CGAAACGCTGAGGGAGGCT-3′。β-actin上游引物:5′-GAAGTGTGACGTTGACAT CCG-3′,下游引物:5′-GCCTAGAAGCATTTGC GGTG-3′,琼脂糖凝胶(1%)电泳分离RT-PCR产物，凝胶成像仪观察图像，分析组间差异。

2 结果

2.1 参茸益精片对高脂血症大鼠血脂水平的影响 大鼠连续饲喂高脂饲料4周后，与对照组比较，模型组大鼠血浆中TC、TG、LDL-C水平显著升高，HDL-C水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，提示大鼠高脂血症动物模型符合实验要求。与模型组比较，参茸益精片治疗组TC、TG、LDL-C水平显著降低，HDL-C水平显著升高(P<0.05)，并呈现一定的剂量依赖性，其效果与临床高脂血症的治疗药物洛伐他汀类似。见表1。

2.2 参茸益精片对高脂血症大鼠肝脏SOD和MDA活性的影响 大鼠连续饲喂高脂饲料4周后，与对照组比较，模型组大鼠肝脏中SOD活性显著降低，MDA活性显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，参茸益精片治疗组SOD活性显著增加，MDA活性显著降低(P<0.05)，并呈现一定的剂量依赖性，其效果与临床高脂血症的治疗药物洛伐他汀类似。见表2。

2.3 参茸益精片对高脂血症大鼠相关分子蛋白表达的影响 本研究结果显示，大鼠连续饲喂高脂饲料4周后，与对照组比较，模型组大鼠肝脏中LDLR表达明显降低(P<0.05)。与模型组比较，

表1 参茸益精片对高脂血症大鼠血脂水平的影响(nmol/L)

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

参茸益精片治疗组和洛伐他汀组大鼠肝脏中LDLR表达显著增加(P<0.05)。与对照组比较，模型组大鼠主动脉VCAM-1和VEGF表达均明显增加(P<0.05)；与模型组比较，参茸益精片治疗组VCAM-1和VEGF表达显著降低(P<0.05)。见图1。

表2 参茸益精片对高脂血症大鼠肝脏SOD和MDA活性的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

图1 参茸益精片对高脂血症大鼠相关分子蛋白表达的影响

注：1.对照组，2.模型组，3.低剂量组，4.中剂量组，5.高剂量组，6.洛伐他汀组

2.4 参茸益精片对高脂血症大鼠相关分子mRNA表达的影响 RT-PCR结果显示，与对照组比较，模型组大鼠主动脉VCAM-1和VEGF mRNA表达均明显增加(P<0.05),而肝脏中LDLR mRNA表达明显降低(P<0.05)；与模型组比较，参茸益精片治疗组大鼠主动脉VCAM-1和VEGF mRNA表达显著降低(P<0.05)，而肝脏中LDLR mRNA表达明显增加(P<0.05)，洛伐他汀组LDLR、VCAM-1和VEGF mRNA表达趋势与参茸益精片治疗组一致。见图2。

3 讨论

参茸益精片的主要有效成分是人参皂苷(Ginsenoside)Rg1、Re和黄芪甲苷(Astragaloside A)，具有复脉固脱、补脾益肝、生津养血的功效，可以达到疏通脉管、改善脏器供血及调节人体代谢功能的目的[9-10]。本研究通过建立大鼠高脂血症动物模型，观察参茸益精片是否具有调节血脂水平的效果，同时通过分子生物学相关技术，分析血脂相关分子的变化，以阐明参茸益精片的作用机制，为其进一步的临床应用提供实验基础和理论依据。

图2 参茸益精片对高脂血症大鼠相关分子mRNA表达的影响

注：1.对照组，2.模型组，3.低剂量组，4.中剂量组，5.高剂量组，6.洛伐他汀组

本研究发现，大鼠连续饲喂高脂饲料4周后，血浆中TC、TG和LDL-C水平均显著升高，HDL-C水平显著降低。同时给予参茸益精片治疗的动物，其血脂水平相关的参数均与模型组有显著的差异，并呈现一定的剂量依赖性。参茸益精片的上述降脂效应，与临床常用的高脂血症治疗药物洛伐他汀类似，提示参茸益精片具有潜在的临床应用前景。

高脂血症分子机制的研究及临床治疗药物和预防手段的探索是目前国内外研究的热点问题。研究结果表明，机体高脂血症状态下，肝脏易出现脂肪堆积，抗氧化能力降低，氧自由基水平显著升高[11-12]。本研究结果表明，高脂饲料处理组的动物，肝脏MDA含量显著升高，SOD活性显著降低，提示高脂动物肝脏清除氧自由基和脂质过氧化产物的能力显著下降。而参茸益精片治疗的动物，肝脏SOD活性显著增加，MDA含量显著降低，提示参茸益精片可以改善肝脏脂质过氧化的程度，减轻因高脂引起的过氧化物生成对肝脏的损伤，从而起到保护肝脏的作用，增强对血浆中TC、TG和LDL-C的处理能力。

基因的变化是引起高脂血症的主要因素，同时也是临床治疗的药物靶点和方向。大鼠肝脏中的LDLR、主动脉组织中的VCAM-1和VEGF均与高脂血症密切相关，LDLR可与LDL结合，显著降低LDL水平，VCAM-1和VEGF均与血管内皮细胞黏附和迁移的进程相关，能够诱导相关细胞因子的表达，参与血管形成[13-18]。肝脏中LDLR的表达与LDL-C和胆固醇的代谢途径密切相关，从而影响肝脏对血浆中TC、TG和LDL-C等的处理能力。增加LDLR水平，可显著提高肝脏对胆固醇的降解能力，降低血脂水平。本研究结果表明，模型组LDLR表达显著降低，而参茸益精片治疗后，大鼠肝脏中LDLR表达显著增加，提示参茸益精片能够增加肝脏对胆固醇的降解，从而降低血脂水平。研究表明，高脂血症可引起主动脉中VCAM-1和VEGF的高表达，促进内皮细胞黏附和迁移，诱导细胞因子表达，引起或加重动脉粥样硬化斑块的形成，造成机体的损害[17-18]。本研究结果表明，经过参茸益精片治疗的动物，其主动脉中VCAM-1和VEGF的表达水平显著降低，提示参茸益精片对主动脉血管有一定的保护作用。综上所述，我们建立的高脂血症的动物模型符合要求，可用于后续的研究。结果表明，给予参茸益精片治疗的动物，其LDLR表达显著增高，VCAM-1和VEGF表达显著降低。RT-PCR实验结果表明，上述分子的mRNA表达水平也体现一样的趋势。参茸益精片可以显著改善机体的血脂水平，可能与调控肝脏和主动脉中相关分子的表达水平密切相关，对于高脂血症，参茸益精片具有一定的治疗效应。

参茸益精片能够显著抑制大鼠高脂血症的发生，可能作为临床治疗并预防高脂血症的药物。本研究为参茸益精片的进一步临床应用提供了实验基础和理论依据。

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