山葡萄酒酿造工艺及其香气成分GC-MS分析

彭彰文，徐天豪，谭新佳，罗思浩，陈 芳，吴竹青，2

（1.吉首大学植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南吉首 416000；2.吉首大学食品科学研究所，湖南吉首 416000）

山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）是无污染野生的山葡萄，不仅含有多种氨基酸，还含有VB1，VB2，VPP，VC，胡萝卜素等多种微量元素。此外，山葡萄酒还富含黄酮类化合物，可预防动脉硬化症和癌症[1-3]。野生的山葡萄，葡萄果粒小、皮厚、色素浓、酸度高、糖度低、单宁含量高，与野生的灵芝、人参一样，营养成分非常丰富，故其市场价值极大[4-6]。

山葡萄酒品质独特，山葡萄酒的传统文化源远流长、历史悠久。武陵山区的居民，长期保持着用山葡萄做酒的习惯。每到秋天，山葡萄熟了，家家自酿山葡萄酒，春节期间用来招待客人，山葡萄酒果香扑鼻、醇和酸涩。国内外当前对于山葡萄酒研究不多，这主要是由于大众对山葡萄酒认知度和研究时间不足，对其研究深度和广度不够，且对其特征的香气成分有待进一步验证。李华等人[7]报道了葡萄酒香气成分的气相色谱分析，研究得出了葡萄酒香气成分气相色谱分析方法的最新研究进展。陶永胜等人[8]采用“电子鼻”等非色谱方法分析葡萄酒香气的特点，阐述了葡萄酒香气成分气相色谱分析的不同检测器方法。现阶段，对于葡萄酒香气成分的分析多采用以气相色谱为代表的色谱技术，气相色谱-质谱联用（GC-MS） 通过色谱的高分离能力和质谱的高鉴别特性，可一次性完成对复杂的混合样品进行分离、定性和定量分析，是一种较完美的现代分析方法[9-10]。

开展山葡萄酒酿造工艺及香气成分变化研究旨在为山葡萄酒酿造提供参考，并通过对山葡萄酒酿造和贮藏过程中香气成分变化进行详细分析，以准确控制山葡萄酒的品质。一方面，实现了对山葡萄酒品质的深入分析，为葡萄酒的生产工艺提供有价值的参考资料；另一方面，武陵山区山葡萄酒的开发，符合当今市场化趋势，具有一定的市场开发价值，同时有利于推动武陵山区的经济发展。

1 试验部分

1.1 主要试剂与仪器

山葡萄，购于吉首市农贸市场，经测定新鲜山葡萄糖度在18%左右；安琪活性干酵母，湖北安琪酵母股份有限公司提供；葡萄糖、蔗糖、偏重亚硫酸钾、壳聚糖等，均为市售食品级。

FA2004型电子天平、722型可见分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品；7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司产品；固相微萃取进样器及萃取纤维头，美国Supelco公司产品。

1.2 工艺流程及操作要点

1.2.1 山葡萄酒精发酵工艺流程

新鲜山葡萄→清洗→除梗、破碎→加偏重亚硫酸钾、果胶酶→加入活化酵母酒精发酵→压榨、分离→后发酵→倒罐→苹果酸-乳酸发酵→陈酿→澄清处理→过滤→杀菌→灌装、封口→山葡萄酒→检验→成品。

1.2.2 操作要点

（1） 原料选用及预处理。采用吉首市山葡萄，采摘时糖度积累要达到18%～22%（手持糖量计测定），含酸量在0.6～1.2 g/100 mL较合适，色素含量高，风味浓郁、典型，无病虫害，果胶酶添加量0.1%～0.2%，酶解温度30～35℃，保持3 h后于73℃条件下进行消毒30 s，然后加入固体偏重亚硫酸钾120 mg/L，使得二氧化硫含量为 40～80 mg/L（GB/T 27586—2011），再根据所需酒精度进行糖度和酸度的调整。

（2）干酵母活化。按试验用量称取活性干酵母，在超净工作台内将安琪酵母加到无菌水（按1 g/mL溶解） 中，在38～43℃的水浴中保持30 min后活化完成，将活化好的酵母液冷却至30℃以下备用。

（3）酒精发酵。将活化后的酵母添加到葡萄汁中。为了充分浸渍皮渣上的色素、单宁及芳香成分，要将皮渣压入葡萄醪中，皮渣很厚并且往往浮在葡萄汁上，与空气直接接触，易感染有害杂菌，此时应将发酵液从桶底放出，用泵将其喷淋在皮渣上，每天1～2次，亦可用压板将皮渣压在液面下30 cm左右，然后进行压榨分离。

（4）压榨分离。山葡萄酒带渣压榨，当主发酵完成后及时压榨取出新酒，采用自流酒（不加压流出）继续进行试验。

（5）陈酿。将山葡萄酒置于橡木桶中，并在通风良好的环境中进行陈酿，陈酿温度12～15℃，环境相对湿度85%～90%，陈酿时间6个月以上。

1.3 山葡萄酒香气成分的GC-MS分析

（1）山葡萄酒样品处理。运用顶空固相微萃取法[11-12]萃取山葡萄果酒香气成分，取山葡萄酒样5 mL于15 mL顶空瓶中，加入1.2 g NaCl，封口，于40℃条件下在磁力搅拌器上平衡20 min，插入老化后的萃取纤维头吸附45 min，于进样口解析5 min后，采集数据。

（2） 色谱条件。色谱柱选择 Agilent190191S-433型石英毛细管（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气（He） 流量1.0 mL/min；进样口温度250℃；不分流进样，程序升温：起始温度35℃，保持5 min，以5℃/min升至110℃，保持2 min，以6℃/min升至150℃，保持2 min，以8℃/min升至220℃，保持10 min。

（3） 质谱条件。四极杆温度150℃，离子源温度230℃，电子能量70 eV，离子化方式EI，分辨率1 000，质量范围30～500 U/s。

1.4 山葡萄酒酿造试验

1.4.1 山葡萄酒精发酵单因素试验

选取酵母菌接种量、发酵温度、发酵时间、发酵pH值为考查因素，以山葡萄酒酒精度为评价指标，进行单因素试验，探究各因素对山葡萄酒精发酵的影响。

1.4.2 山葡萄酒酒精发酵正交试验

在单因素试验的基础上，以酒精度作为评判指标，把酵母菌接种量、发酵温度、发酵时间、发酵pH值作为考查因素，进行四因素三水平正交试验，确定山葡萄酒精发酵的最佳工艺条件。

1.5 感官评价

评价指标采用感官综合评分，选择师生共10人组成评价小组，对山葡萄酒样品的色泽、口感、体态、风味等进行评价（100分计），取其平均值作为样品的最终得分。

山葡萄酒感官品质综合评分标准见表1。

1.6 数据分析

正交试验结果及验证性结果用SPSS 20.0统计软件处理，结果表示为平均值±标准偏差（X±S）。方差分析比较用t检验，p<0.05时为显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 山葡萄酒精发酵单因素试验

2.1.1 发酵温度对山葡萄酒精发酵效果的影响增强，酒精度呈上升趋势，当pH值超过3.4时，酵母菌活性降低，酒精度开始下降且在pH值为3.4时酒精度最大。因此，酵母发酵pH值应以3.4左右为宜。

表1 山葡萄酒感官品质综合评分标准

2.1.3 酵母菌接种量对山葡萄酒精发酵效果的影响

取100 mL葡萄糖汁置于250 mL锥形瓶中，发酵pH值3.2，发酵温度28℃，分别加入果汁用量0.04%，0.06%，0.08%，0.10%，0.12%，0.14%，0.16%的活化酵母，恒温发酵60 h。测量酒精度，研究酵母菌接种量对山葡萄酒精发酵的影响。

酵母菌接种量对山葡萄酒精发酵的影响见图3。

取100 mL山葡萄汁置于250 mL锥形瓶中，固定酵母菌接种量0.10%，发酵pH值3.2，分别在温度22，24，26，28，30，32，34℃下恒温发酵60 h。测量酒精度，研究发酵温度对山葡萄酒精发酵的影响。

发酵温度对山葡萄酒精发酵的影响见图1。

图3 酵母菌接种量对山葡萄酒精发酵的影响

图1 发酵温度对山葡萄酒精发酵的影响

由图1可知，当发酵温度超过22℃时，山葡萄酒精度随发酵温度增加而显著增加，并在发酵温度为30℃取得最大值；当发酵温度超过30℃后，山葡萄酒精度呈下降趋势，故发酵温度以30℃左右为宜。

2.1.2 发酵pH值对山葡萄酒精发酵效果的影响

取100 mL山葡萄汁置于250 mL锥形瓶中，固定酵母菌接种量0.10%，发酵温度28℃，分别调节pH 值为 2.6，2.8，3.0，3.2，3.4，3.6，3.8，恒温发酵60 h。测量酒精度，研究发酵温度对山葡萄酒精发酵的影响。

发酵pH值对山葡萄酒精发酵的影响见图2。

图2 发酵pH值对山葡萄酒精发酵的影响

由图2可知，随着发酵pH值增加，酵母菌活性

由图3可知，酵母菌接种量0.04%～0.10%的范围内，山葡萄酒精度随酵母菌接种量增加而呈上升趋势，酵母菌接种量在0.10%时，山葡萄酒精度达到最大；当酵母菌接种量超过0.10%后，山葡萄酒精度开始下降。因此，酵母菌接种量以0.10%左右为宜。

2.1.4 发酵时间对山葡萄酒精发酵效果的影响

取100 mL山葡萄汁置于250 mL锥形瓶中，固定酵母菌接种量0.10%，发酵温度28℃，发酵pH值3.2，分别恒温发酵 24，36，48，60，72，84，96 h，测量酒精度，研究发酵时间对山葡萄酒精发酵的影响。

发酵时间对山葡萄酒精发酵的影响见图4。

图4 发酵时间对山葡萄酒精发酵的影响

图4 结果表明，在发酵时间为24～72 h时，发酵液中氧气含量充足，酵母菌代谢旺盛，山葡萄酒精度随发酵时间的增加而增加，当发酵时间为72 h时，山葡萄酒精度达最高；发酵时间超过72 h后，山葡萄酒精度呈缓慢下降趋势。因此，发酵时间应在72 h左右为宜。

2.2 山葡萄酒精发酵正交优化试验

在单因素试验基础上，以酒精度作为评价指标，以酵母菌接种量、发酵温度、发酵时间、发酵pH值为考查因素，选择较优因素，即发酵温度28，30，32℃，发酵pH值3.0，3.2，3.4，酵母菌接种量0.10%，0.15%，0.20%，发酵时间48，60，72 h，通过L9（34）正交试验对发酵条件进行优化。

正交因素与水平见表2，正交试验结果与分析见表3，正交试验方差分析结果见表4。

表2 正交因素与水平

表3 正交试验结果与分析

表4 正交试验方差分析结果

由表2可以看出，D＞A＞C＞B，正交试验的各因素水平中发酵时间、发酵温度、酵母菌接种量、发酵pH值对山葡萄酒精发酵的影响是依次减小的。由表3可知优水平组合为A2B3C2D3，即酵母菌接种量0.15%，发酵pH值3.4，发酵温度30℃，发酵时间72 h。在此优化工艺条件下，山葡萄发酵液酒精度实测值为8.4%（V/V），感官评分实测值为83分。

2.3 山葡萄酒香气成分GC-MS分析结果

该试验主要是对山葡萄发酵酒及发酵酒贮藏3个月、贮藏7个月酒样进行了GC-MS分析。

新山葡萄酒样香气成分总离子流色谱图见图5，陈酿3个月山葡萄酒香气成分总离子流色谱图见图6，陈酿6个月山葡萄酒香气成分总离子流色谱图见图7，山葡萄酒香气成分分析见表5。

图5 新山葡萄酒样香气成分总离子流色谱图

图6 陈酿3个月山葡萄酒香气成分总离子流色谱图

图7 陈酿6个月山葡萄酒香气成分总离子流色谱图

表5 山葡萄酒香气成分分析

（续表5）

在贮藏过程中，其香气成分中的醇类酯类物质变化较大，随着陈酿时间的进行，3-甲基-1-丁醇由8.718%增加到24.478%，壬酸乙酯由2.389%增加到4.547%，其他物质含量没有大的波动。因此，山葡萄酒在酿造过程中的主要香气成分主要为壬酸乙酯、3-甲基-1-丁醇，同时乙酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙醇等酯类和醇类物质也对酒液香气有重要贡献。

在葡萄酒生产中，醇类和酯类化合物是葡萄酒酵母发酵过程中的主要产物，对葡萄酒的香味具有重要影响，适量的高级醇可以给葡萄酒带来良好香气，酯类和酸类等化合物含量的不同使葡萄酒在风味上产生很大的差别。在武陵山葡萄酒酿造和陈酿过程中，醇类与酯类物质变化较大，这与发酵的工艺条件和陈酿的温度、容器等有关，但是对香气物质在发酵和山葡萄酒陈酿过程中的相关生理和化学变化的机理尚不明确。因此，对加强仪器功能及效率提出了新要求，对香气物质变化机理探讨、掌握葡萄及发酵过程中香气成分的形成机制问题，还有待进一步深入研究。

3 结论

以武陵山地区山葡萄为原料，研究山葡萄酒酿造工艺和陈酿过程中香气成分的变化。在单因素试验基础上，通过正交试验优化得到山葡萄酒发酵工艺最优参数，即酵母菌接种量0.15%，发酵pH值3.4，发酵温度30℃，发酵时间72 h。在此优化工艺条件下，山葡萄发酵液酒精度实测值为8.4%（V/V），所得山葡萄酒色泽呈深红色，酸味协调且具山葡萄独特风味，清香爽口，略带涩味，感官评分实测值为83分。

山葡萄酒陈酿过程中香气成分变化，对山葡萄酒的风味口感有着很重要的影响，通过顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术，分析了新酿制山葡萄酒、山葡萄酒陈酿3个月和6个月香气成分的变化情况。结果表明，山葡萄酒在酿造过程中，醇类与酯类的变化较大，其中主要香气成分为壬酸乙酯和3-甲基-1-丁醇，同时乙酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙醇等酯类和醇类物质也是构成山葡萄酒香气成分的重要组成部分。

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