超声波辅助法提取火龙果果皮多糖工艺优化及其抗氧化活性研究

但德苗，余 侠，胡珊珊，钱时权，伍亚华

（蚌埠学院食品与生物工程学院，安徽蚌埠 233030）

火龙果属仙人掌科，原产于中美洲，后传入中国，是热带、亚热带水果。火龙果果皮中含有大量植物多糖[1]，研究表明，植物多糖具有多种生物活性，如抗氧化、调节免疫、抗肿瘤、降血糖、抑菌等[2-5]。目前，已有对火龙果果茎和果肉[6-7]多糖方面的文献报道，而关于火龙果果皮多糖提取方面的研究还未曾有过报道。

植物多糖的提取方法主要有热水浸提法、超声波辅助法和微波辅助法等。超声波辅助法主要利用超声波的空化和机械效应来破坏植物细胞壁，加快细胞内活性物质的溶出，具有提取时间短和提取效率高等特点。以火龙果果皮为原料，研究火龙果果皮超声波辅助法提取工艺，并对提取得到的火龙果多糖体外抗氧化活性进行评价，以期为火龙果果皮副产物资源的高效开发利用提供理论和技术参考。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

火龙果、菜籽油，购于蚌埠华运超市；无水乙醇、30%过氧化氢、硫酸亚铁、葡萄糖、水杨酸、苯酚、浓硫酸、（2,2'-联氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸） 二铵盐（ABTS）、过硫酸钾、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT），均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TGL-16B型高速离心机，上海安亭科学仪器厂产品；FS-4501V型超声波萃取仪，上海生析超声仪器有限公司产品；752型紫外可见分光光度计，上海光学仪器厂产品；FA2004B型电子分析天平，上海精密仪器仪表有限公司产品。

2 试验方法

2.1 火龙果果皮多糖的提取

选取新鲜的火龙果皮，充分洗涤后，在60℃条件下烘制至恒质量粉碎，过60目筛制成粉末；准确称取5.00 g火龙果果皮粉末置于锥形瓶中，加入适量蒸馏水；置于超声波萃取仪中，在一定功率下提取多糖，萃取后的多糖溶液以转速6 000 r/min离心10 min，获得上清液；向上清液中加入3倍体积的无水乙醇，于4℃条件下醇沉12 h；以转速6 000 r/min离心10 min，收集沉淀，经真空干燥后，得到火龙果果皮多糖粉末。

2.2 火龙果果皮多糖提取率的测定

精密称取干燥的葡萄糖10.00 mg，定容至100 mL，配制成0.10 mg/mL的葡萄糖标准溶液；分别准确吸取质量浓度为0.10 mg/mL的葡萄糖标准溶液0，0.10，0.30，0.50，0.70，0.90，1.10 mL于 7支刻度试管中，加蒸馏水至2.0 mL；再向7支刻度试管中分别加入5%的苯酚溶液1.0 mL，摇匀后迅速加入5.0 mL浓硫酸，沸水浴加热15 min，冷却至室温，并以蒸馏水做空白对照，于波长490 nm处测定吸光度；以葡萄糖质量浓度（X）为横坐标、吸光度（Y）为纵坐标，绘制出标准曲线（Y=0.129 5X-0.114 2；R2=0.999 7）；量取2.0 mL火龙果果皮多糖供试液，按上述方法测定吸光度，计算多糖含量。按照以下公式计算火龙果皮多糖提取率。

式中：C——供试液的多糖质量浓度，mg/mL；

A——供试液总体积，mL；

n——稀释倍数；

a——测定供试液的体积，mL；

M——火龙果果皮粉末的质量，g。

2.3 火龙果果皮多糖超声波辅助提取单因素试验

2.3.1 料液比对火龙果果皮多糖提取率的影响

准确称取火龙果果皮粉3.00 g，在保持其他条件不变时，分别选取料液比1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12（g∶mL），按照2.1和2.2方法提取火龙果果皮多糖，计算火龙果果皮多糖提取率，考查料液比对火龙果果皮多糖提取率的影响。

2.3.2 超声功率对火龙果果皮多糖提取率的影响

准确称取火龙果果皮粉3.00 g，在保持其他条件不变时，分别选取超声波功率60，80，100，120，140 W，按照2.1和2.2方法提取火龙果果皮多糖，计算火龙果果皮多糖提取率，考查超声功率对火龙果果皮多糖提取率的影响。

2.3.3 超声时间对火龙果果皮多糖提取率的影响

准确称取火龙果果皮粉3.00 g，在保持其他条件不变时，分别选取超声时间15，20，25，30，35 min，按照2.1和2.2方法提取火龙果果皮多糖，计算火龙果皮多糖提取率，考查超声时间对火龙果果皮多糖提取率的影响。

2.4 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，选取料液比（X1）、超声功率（X2）和超声时间（X3）3个因素，以火龙果果皮多糖提取率（Y）为响应值，采用Box-Behnken试验设计方法优化火龙果果皮多糖超声辅助提取工艺参数。

试验因素与水平设计见表1。

表1 试验因素与水平设计

2.5 火龙果果皮多糖体外抗氧化活性试验

2.5.1 ABTS自由基的清除能力

ABTS自由基清除能力的测定参考文献[8]，并略做修改。准确量取等体积浓度为7.4 mmol/L ABTS自由基和浓度为2.6 mmol/L过硫酸钾溶液，暗处反应15 h后，用磷酸缓冲液（pH值7.4） 适当稀释ABTS自由基。分别取3.0 mL不同质量浓度的多糖溶液（0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL） 与 6.0 mL ABTS自由基稀释液混合均匀，于室温下反应8 min后，同时以VC为对照，分别以6.0 mL蒸馏水代替ABTS自由基稀释液作为本底和空白对照。于波长752 nm处测定吸光度，计算ABTS自由基清除率。

式中：A0——空白对照吸光度；

A1——样品吸光度；

A2——本底吸光度。

2.5.2 油脂抗氧化能力

参照文献[9]进行，并略做修改，称取5.0 g菜籽油作为油样，将3.0 mL多糖溶液（1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg/mL） 加入到油样中，于70℃烘箱中强化60 min，同时以BHT为对照。采用碘量法按国标GB/T 5538—2005测定菜籽油的过氧化值（POV）。

式中：M——碘生成物质的量，mmol；

m——油脂质量，kg。

3 结果与分析

3.1 单因素试验

3.1.1 料液比对火龙果果皮多糖提取率的影响

料液比对火龙果果皮多糖提取率的影响见图1。

图1 料液比对火龙果果皮多糖提取率的影响

从图1可以看出，随着料液比的增加，火龙果果皮多糖提取率呈先升高后降低的趋势。在料液比为1∶8时，火龙果果皮多糖提取率达到最大，随后逐渐降低。因此，料液比选择1∶8较为适宜。

3.1.2 超声功率对火龙果果皮多糖提取率的影响

超声功率对火龙果果皮多糖提取率的影响见图2。

图2 超声功率对火龙果果皮多糖提取率的影响

由图2可知，火龙果果皮多糖提取率随超声功率增加而提高，这可能是因为随着超声功率的增加，超声波的空穴、机械和热作用增强而多糖溶出速率加快。在超声功率为100 W时火龙果果皮多糖提取率达到最大值，而超声功率100 W之后火龙果果皮多糖的提取率维持不变。因此，应控制超声功率在100 W为宜。

3.1.3 超声时间对火龙果果皮多糖提取率的影响

超声时间对火龙果果皮多糖提取率的影响见图3。

图3 超声时间对火龙果果皮多糖提取率的影响

由图3可知，不难发现，火龙果果皮多糖提取率随着超声时间的延长而增加，当超声时间超过25 min后，火龙果果皮多糖提取率呈平缓下降趋势。超声波在工作时会产生强烈的剪切作用，而这可能会使多糖分子遭到破坏，从而影响火龙果果皮多糖的提取效率。由此，控制超声时间以25 min为宜。

3.2 优化火龙果果皮多糖提取工艺

综合分析单因素试验结果，选取料液比（X1，g∶mL）、超声功率 （X2，W） 和超声时间 （X3，min）为自变量，以火龙果果皮多糖提取率（Y，%）为响应值，进行响应面优化。

响应面试验结果见表2。

表2 响应面试验结果

根据表2的结果，建立火龙果果皮多糖提取率对料液比、超声功率和超声时间二次多元回归方程为：

根据表2结果，进行方差分析。

方差分析见表3。

由表2和表3可知，模型（p<0.01） 极显著。由F值大小可知，影响红皮火龙果果皮多糖提取率主要因素主次顺序为 X2＞X1＞X3，即超声功率＞料液比＞超声时间。 由p值可知，一次项X1，X2和X3极显著（p<0.01），即料液比、超声功率和超声时间对火龙果果皮多糖提取率影响极显著。交互项X2X3影响显著（p<0.05）和二次项（X12，X22，X32）影响均极显著（p<0.01），失拟项p=0.095 2＞0.05，说明失拟项不显著，该模型的拟合度较好。R2=0.991 3，表明此模型能解释99.93%的响应变化。上述结果表明，所得到的回归方程能很好地预测火龙果果皮多糖提取率与料液比、超声功率和超声时间各因素间的关系。

3.3 响应面分析

料液比（X1，g∶mL） 和超声功率（X2，W） 对火龙果果皮多糖提取率的影响见图4，料液比（X1，g∶mL） 和超声时间（X3，min） 对红龙果果皮多糖提取率的影响见图5，超声功率（X2，W）和超声时间（X3，min）对红龙果果皮多糖提取率的影响见图6。

表3 方差分析

图4 料液比（X1，g∶mL） 和超声功率（X2，W） 对火龙果果皮多糖提取率的影响

图5 料液比（X1，g∶mL） 和超声时间（X3，min） 对红龙果果皮多糖提取率的影响

图6 超声功率（X2，W） 和超声时间（X3，min） 对红龙果果皮多糖提取率的影响

图4 ～图6反映了料液比（X1）、超声功率（X2）和超声时间（X3）对火龙果果皮多糖提取率的交互影响。由图4可知，当超声时间固定时，料液比曲面的变化幅度要低于超声功率，说明超声波功率对多糖提取率的影响较大。等高线图为圆形，表明料液比和超声功率对火龙果果皮多糖提取率的交互作用不显著。由图5可知，当超声功率固定时，超声时间曲面变化幅度低于料液比，说明料液比对火龙果果皮多糖提取率的影响较大；等高线图表明，料液比和超声功率交互作用不显著。由图6可知，当料液比固定时，超声功率曲面的变化幅度大于超声时间曲面的变化幅度，说明超声功率对火龙果果皮多糖提取率的影响较大；等高线图接近椭圆形，说明超声功率和超声时间对火龙果果皮多糖提取率交互影响较显著。

根据建立的数学回归模型，进行参数的最优化分析，得出火龙果果皮多糖超声波辅助提取的最佳条件为料液比1∶8，超声功率101.30 W，超声时间26.10 min；在此工艺条件下，得到火龙果果皮多糖提取率的最大预测值为13.9%。考虑到实际操作情况，对最佳条件进行了适当调整：料液比1∶8，超声功率101 W，超声时间26 min，在此工艺条件下，进行3次重复试验，得到红皮火龙果果皮多糖的实际提取率为13.88%，平均误差为1.52%（n=3），试验值与理论值基本吻合。以上结果表明，所获得的模型能有效用于火龙果果皮多糖的超声波辅助提取。

3.4 火龙果果皮多糖的体外抗氧化活性

3.4.1 ABTS自由基清除能力

火龙果果皮多糖对ABTS自由基的清除能力见图7。

图7 火龙果果皮多糖对ABTS自由基的清除能力

由图7可知，不难发现，火龙果果皮多糖对ABTS自由基有明显的清除作用。随着火龙果果皮多糖质量浓度的增加，ABTS自由基清除率逐渐增强（p<0.01）。当质量浓度超过为2.0 mg/L时，火龙果果皮多糖对ABTS自由基的清除率与VC差异不显著（p＞0.05）。当火龙果果皮多糖质量浓度为2.5 mg/mL时，火龙果果皮多糖对ABTS自由基的清除率可达到99.10%。

3.4.2 火龙果果皮对菜籽油的抗氧化性能

油脂氧化反应所生成的过氧化物，是油脂氧化酸败的关键产物。因此，测定油脂POV值，可判定其氧化变质的程度。当过氧化值明显升高时，表明油脂的氧化稳定性下降，酸败即将开始。

火龙果果皮多糖的菜籽油抗氧化作用见图8。

由图8可知，火龙果果皮多糖对菜籽油的抗氧化作用随着多糖质量浓度的增加而逐渐增强（p<0.05）。当质量浓度超过为5.0 mg/L时，火龙果皮多糖与等质量浓度BHT的菜籽油抗氧化作用相当。

图8 火龙果果皮多糖的菜籽油抗氧化作用

4 结论

研究了料液比、超声功率和超声时间对火龙果果皮多糖提取率的影响，采用响应曲面法优化了火龙果果皮多糖的超声辅助提取工艺条件。结果表明，料液比、超声功率和超声时间对火龙果果皮多糖提取有显著影响。得到超声辅助法提取火龙果果皮多糖的最佳工艺条件为料液比1∶8，超声功率101 W，超声时间26 min，在此条件下，火龙果果皮多糖提取率为13.88%，火龙果果皮多糖能有效清除ABTS自由基，对菜籽油也具有显著抗氧化作用。

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