载STEAP-1抗体前列腺癌靶向超声微泡的制备及体外寻靶实验研究

刘莹，江峰，袁韵

(皖南医学院弋矶山医院 超声医学科，安徽 芜湖 241001)

近年来，随着我国人口的老龄化和人们生活、饮食习惯的变化，前列腺癌的发病率逐渐上升[1]。随着超声分子成像技术的发展，超声靶向造影已成为超声研究的新领域[2]，因普通的声诺维造影剂无定向选择作用，不能显著提高前列腺癌超声诊断的敏感性和特异性[3]。靶向微泡造影剂则是在微泡表面上连接特异性抗体或配体，凭借抗原特异性结合抗体或配体特异性结合受体，经血液循环后浓聚到特异的靶器官或靶组织，实现特异性增强显影[4-5]。靶向超声微泡造影为前列腺癌诊疗研究提出了新方向[6]。

本研究拟通过采用生物素-亲和素连接法将载前列腺跨膜上皮抗原-1(STEAP-1)抗体与普通微泡结合制备载STEAP-1抗体的靶向微泡，通过免疫荧光法判定靶向微泡是否成功制备，流式细胞术评估靶向微泡的结合率和稳定性；体外培养人前列腺癌细胞，评价其与靶向微泡体外结合能力，将普通微泡设为对照组，检测其结合率、稳定性及体外寻靶能力。

1 实验方法及步骤

1.1 细胞培养

1.1.1 细胞复苏 从-80 ℃冰箱中取出冻存的前列腺癌细胞LNCaP、PC3，快速投入至水浴锅中，不断摇动令冻存管中液体尽快融化，避免由于融化过慢对细胞造成损害。将其内细胞混合液移送至离心管中，1 000 r·min-1离心5 min，倒去上清液。向离心管内滴入4 ml培养基，细胞悬液吹匀后接种至细胞培养瓶内，置于37 ℃恒温CO2温箱中，培养至次日更换培养基。

1.1.2 细胞传代 当生长期细胞密度较高(达80%～90%)时及时传代。倒去旧培养基，加入1 ml胰酶细胞消化液，置恒温CO2培养箱中消化1～2 min，镜下观察细胞形态，待大部分细胞变圆，再振拍瓶壁使贴壁细胞脱壁浮起，加1 ml培养基使消化终止。一次性吸管吹匀移至离心管中离心，去上清后滴入新培养基，吸管吹匀，将细胞悬液(LNCaP细胞按1∶2、PC3细胞按1 ∶3)分入新的培养瓶中培养。

1.2 检测STEAP-1蛋白在LNCaP及PC3细胞中的表达

1.2.1 免疫荧光法定性检测 细胞爬片先用PBS缓冲液漂洗3遍，4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS缓冲液漂洗3遍，加入5%牛血清白蛋白(BSA)封闭30 min，吸去多余BSA后加入STEAP-1抗体(1∶1 000)，置4 ℃冰箱6 h；滴加异硫氰酸荧光素(FITC)标记的IgG(1∶200)，孵育反应1～2 h后，PBS缓冲液漂洗3遍，置于荧光显微镜下观察染色情况。

1.2.2 BCA法测定蛋白含量 从BCA试剂盒中取出A液4 ml、B液80 μl，取10 μl标准品加PBS缓冲液稀释，使终浓度至0.5 mg·ml-1。另取孔加入4 μl的待测样品LNCaP、PC3蛋白，PBS缓冲液补足至20 μl，分别加入200 μl BCA工作液，37 ℃水浴30 min，冷却后置于酶标仪中测定A562 nm，计算出两种蛋白的浓度。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 配置好10%分离胶后灌胶，待观察到分离胶凝固后灌入5%浓缩胶，加电泳液后使用微量移液器缓慢上样。浓缩胶以恒定电压80 V电泳约30 min，分离胶以恒定电压150 V电泳约1 h，待溴酚兰刚跑出时终止电泳。

1.3 载STEAP-1抗体靶向微泡的制备

1.3.1 制备声诺维微泡 向声诺维冻干粉中注入5 ml的生理盐水，剧烈振荡20 s至瓶中内容物呈乳白色气液混合状。

1.3.2 生物素-亲和素标记微泡 取上述配制的微泡混合液，加入500 μg生物素化脂质(DSPE-PEG-Biotin)，充分混合后置于37 ℃恒温摇床中轻摇1 h。在4 ℃下离心4 min，抽弃下层液体，漂浮法重复洗涤2遍。 于生物素化微泡中加入50 μg链霉亲和素，置于4 ℃冰箱中避光孵育反应30 min后洗涤。

1.3.3 结合生物素化STEAP-1抗体 利用生物素-亲和素系统亲和力与靶向微泡结合。于上述微泡混合液中加入25 μg生物素化STEAP-1抗体，继续避光反应30 min后洗涤、离心、定容。

1.4 载STEAP-1抗体靶向微泡的免疫荧光检测

取上述制备好的声诺维微泡和靶向微泡各100 μl，分别加入FITC标记的IgG(1∶200，避光)，充分混匀，室温下反应30 min，洗涤2次。分别取10 μl普通微泡和靶向微泡涂片，于荧光显微镜下观察两者的染色情况。

1.5 靶向微泡的体外结合率与稳定性

利用流式细胞仪评估STEAP-1抗体与微泡的结合率；将获得的检测数据进行分析，以判断其稳定性。

1.6 体外靶向结合实验

1.6.1 结合实验 (1) 取对数生长期的LNCaP、PC3细胞各制备细胞爬片，4%多聚甲醛固定、5%BSA封闭。上述爬片分成两组，每组10张，分别与靶向微泡和普通声诺维微泡即靶向组A和对照组B反应，两组再分别均分成Al、Ap和Bl、Bp，Al、Bl与LNCaP细胞反应，Ap、Bp与PC3细胞反应。(2) 取适量上述制备的靶向微泡和普通微泡。镜下观察微泡的分布情况，PBS缓冲液洗涤后置于载玻片上，镜下比较观察两种微泡分别与细胞的结合情况，PBS缓冲液再次冲洗后继续观察。

1.6.2 结合率判定方法[7]在每张爬片上随机取10个视野，将微泡结合数目达5个以上(包括5个)的单个细胞视为阳性细胞，对每个视野进行阳性细胞计数。

1.7 实验数据的统计学处理

2 结 果

2.1 前列腺癌细胞中STEAP-1蛋白的表达

荧光显微镜下LNCaP细胞、PC3细胞分别与STEAP-1抗体、FITC标记的IgG(1∶200)染色结果(图1、2)显示，细胞爬片的视野内均可见细胞表面发出绿色荧光。由此定性检测可知，LNCaP细胞、PC3细胞中STEAP-1蛋白的表达均呈阳性。

图1LNCaP细胞荧光显微镜照片×200

图2PC3细胞荧光显微镜照片×200

2.2 超声微泡的性状

2.2.1 普通声诺维微泡 制备的普通声诺维微泡外观呈乳白色，光镜下呈圆形，分布均匀(图3A)；加FITC标记的IgG(1∶200)荧光显微镜下观察，视野丢失、未见荧光(图3B)。

图3光镜下(A)和荧光镜下(B)的声诺维微泡×100

2.2.2 载STEAP-1抗体的靶向微泡 载STEAP-1抗体的靶向微泡肉眼观亦呈乳白色，大小均一、分布均匀(图4A)；靶向微泡与FITC标记的IgG(1∶200)荧光显微镜下，微泡表面呈现环状绿色荧光(图4B)。由此表明，连接有STEAP-1抗体的靶向微泡能特异性结合IgG。

图4光镜下(A)和荧光显微镜下(B)的靶向微泡×100

2.3 靶向微泡的结合率及稳定性检测

流式细胞术检测结果(图5)显示，靶向微泡结合率高达(89.11±3.27)%，对照组仅为(0.65±0.03)%；手摇振荡后检测靶向微泡结合率为(88.52±3.70)%，对照组为(0.65±0.03)%。振荡前、后微泡结合率均明显高于对照组(P<0.05，图6)。对振荡前后微泡结合率进行配对t检验，结果显示差异无统计学意义(P>0.05，图7)。由此表明，STEAP-1抗体能与微泡牢固结合。

2.4 靶向微泡的体外寻靶检测

靶向微泡与前列腺癌细胞充分孵育反应后，未用PBS缓冲液冲洗前镜下观察可见微泡分布不均匀，向细胞区域聚集(图8A、B)；用PBS缓冲液冲洗后镜下观察仅见细胞周边黏附大量微泡(图9A、B)，Al组LNCaP细胞黏附率为(86.82±1.88)%，Ap组PC3细胞黏附率相对较低，为(79.08±3.64)%，对两组细胞黏附率行独立样本t检验显示差异有统计学意义(P<0.05)；再次用PBS缓冲液冲洗(图10A、B)，Al组LNCaP细胞、Ap组PC3细胞的黏附率分别为(86.53±1.96)%、(78.82±3.58)%，对黏附率进行配对样本t检验均显示差异无统计学意义(P>0.05)；对照B组的普通Sono Vue微泡在PBS缓冲液冲洗后几乎完全消失。证明载STEAP-1抗体靶向微泡可特异性地结合前列腺癌细胞。

图5流式细胞仪检测结果

图6振荡前靶向组与普通对照组微泡结合率的比较

图7靶向组振荡前后微泡结合率的比较

3 讨 论

目前国内外前列腺癌的发病率和死亡率都较高[8]。本研究制备出新型的靶向超声造影剂，选择雄激素依赖型前列腺癌细胞株LNCaP作为实验组细胞、雄激素非依赖型前列腺癌细胞株PC3则作为对照组细胞。免疫荧光定性检测结果显示，与STEAP-1抗体充分孵育反应后，LNCaP细胞和PC3细胞表面均能呈现出绿色荧光，即STEAP-1在两种细胞中均呈阳性表达。LNCaP细胞中检测到的STEAP的表达水平是最高的，且与PC3细胞株相比，STEAP-1蛋白在LNCaP细胞株中呈相对高水平表达，这也说明了LNCaP细胞是前列腺癌体内外寻靶实验研究的最佳细胞株。

本研究选择结合稳固的生物素-亲和素连接法，借助生物素-亲和素系统高度亲和力，实现靶向微泡与STEAP-1抗体牢固结合。STEAP-1分子作为组织靶向标记物，制备出载STEAP-1抗体的靶向超声微泡，为前列腺癌靶向研究指出了新的角度。STEAP还可能具备诱导细胞快速增长的功能[9]。这表明STEAP-1是与前列腺癌患者预后紧密相关的生物标志分子。

图8Al组LNCaP细胞(A)和Ap组PC3细胞(B)爬片PBS缓冲液冲洗之前×100

图9Al组LNCaP细胞(A)和Ap组PC3细胞(B)爬片PBS缓冲液冲洗之后×200

图10Al组LNCaP细胞(A)和Ap组PC3细胞(B)爬片PBS缓冲液再次冲洗后×200

连接STEAP-1抗体的靶向微泡可特异性结合FITC标记的二抗，即载STEAP-1抗体靶向微泡[10]。流式细胞术检测STEAP-1抗体和普通声诺维微泡的结合率及结合的稳定性，结果显示结合率较高，可见STEAP-1抗体能与普通声诺维微泡结合，且与对照组结合率之间有明显差异；对微泡施加适当外力振荡后重新检测各组的结合率，对振荡前后对比分析显示，两者之间差异无统计学意义，表明施加振荡外力对STEAP-1抗体与微泡外壳的结合未产生明显的影响，即两者结合较为牢固，证明所制备的载STEAP-1抗体靶向微泡稳定性良好。

将载STEAP-1抗体靶向微泡与前列腺癌细胞充分接触后镜下观察发现，靶向微泡分布不均匀，出现明显的聚集现象，向细胞区域集中，而对照组微泡却并无此聚集现象，仍均匀分布。缓冲液冲洗后，实验组能观察到前列腺癌细胞表面环绕大量微泡，余下视野内微泡被冲洗干净，对照组镜下仅能观察到极少数微泡黏附甚至无微泡黏附的前列腺癌细胞，实验组与对照组的黏附率有差异，前者黏附率明显高于后者。上述实验结果表明STEAP-1抗体已成功连接到靶向微泡上，且具备前列腺癌特异性寻靶能力。靶向微泡与LNCaP细胞、PC3细胞的黏附有差异，LNCaP细胞的黏附率高于PC3细胞，可能与STEAP-1在前者中的表达水平较高有关。

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