H9N2亚型禽流感灭活疫苗 对山鸡免疫效果的评估

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(1.上海欣灏珍禽育种有限公司，上海 奉贤201403； 2.上海市奉贤区动物疫病预防控制中心，上海 奉贤201400)

0 引言

近年来，随着社会发展和物质生活水平的不断提高，人们对名特优新产品的需求也不断增长，而山鸡因其外貌绚丽多彩、肉质细嫩鲜美、野味浓郁醇厚、营养丰富齐全而成为了人们的首选，市场需求与日俱增，人工养殖的规模和数量逐年上升。据不完全统计，目前国内存栏商品种山鸡约200万套，年上市商品肉山鸡近亿羽、商品山鸡蛋约5亿枚，成为了特种养殖中规模最大的品种。自然环境下，野外生活山鸡的抗病能力较强，几乎无疾病发生。但近年来高密度的人工饲养，在加速山鸡抗病能力退化的同时，也显著增加了各类疾病的发生概率，特别是H9N2亚型禽流感等疫病，已严重危害了产业的发展。

目前国内养殖户基本都是参照家禽的推荐程序进行免疫，没有专门适用于山鸡的H9N2亚型禽流感的免疫程序，也未见系统开展山鸡H9N2亚型禽流感免疫抗体消涨规律研究的报导，免疫失败现象时有发生。为此，笔者根据多年从事山鸡养殖和各类疫病防控的经验，开展了针对种山鸡一个世代的H9N2亚型禽流感免疫与抗体效价的评估试验。

1 材料与方法

1.1 材料

(1)试验山鸡。上海某珍禽育种有限公司1日龄祖代种山鸡苗雏1万羽，2016年7月2日出雏；其入孵种蛋为43周龄健康种母山鸡所产，并严格按照孵化流程入孵。该批试验山鸡的种母鸡(43周龄)其时已按家禽免疫程序分别于33日龄、69日龄和125日龄实施H9N2亚型禽流感灭活疫苗免疫。

(2)免疫疫苗。禽流感灭活疫苗(H9N2亚型，F株)；生产商：青岛易邦生物工程有限公司；批准文号:兽药生字(2015)150132066；批号：160190405；有效期：2017年06月23日。

(3)检测试剂。①抗原：禽流感病毒H9N2亚型血凝抑制试验抗原，生产商：哈尔滨维科生物技术开发公司，批号：2017001。②标准阳性血清：禽流感病毒H9N2亚型血凝抑制试验阳性对照血清，生产商：哈尔滨维科生物技术开发公司，批号：2016001。③标准阴性血清：禽流感病毒H9N2亚型HI试验阴性对照血清，生产商：哈尔滨维科生物技术开发公司生产，批号：2016003。④红细胞：1%鸡红细胞悬液：采集无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡全血，与等体积阿氏液混合，用pH值7.2、0.01moL/L PBS液洗涤3次，每次均以2 500～3 000 rpm/min离心5 min，洗涤后用PBS液配成1%鸡红细胞悬液，2℃～8℃冰箱保存备用。

1.2 方法

(1)试验山鸡饲养。①育雏期饲养方式:0～35日龄为育雏期；雏山鸡采用四层叠层式立体育雏笼饲养。②保育期饲养：36～55日龄为保育期，采用双层阶梯式保育笼饲养。③育成期饲养:分育成前期和育成后期2个阶段，其中：56～120日龄为育成前期，采用暗光照地面平养方式饲养；121日龄～开产(190～195日龄)为育成后期，又称为产蛋准备期，采用3层叠层单鸡单笼式种山鸡笼饲养。④种用期:开产～淘汰(一般持续种用至56周龄全群淘汰)为种用期。采用3层叠层单鸡单笼式种山鸡笼饲养。

(2)免疫。根据家禽H9N2亚型禽流感推荐免疫程序，结合山鸡生理特性和饲养特点，试验沿用该公司原先使用的免疫程序对试验山鸡全群进行H9N2亚型禽流感免疫，详见表1。

表1 H9N2亚型禽流感灭活疫苗免疫情况汇总表

(3)采样与样品处理。①种母山鸡采样：对该批试验山鸡的种母山鸡，在留取种蛋(43周龄)时随机采取20份血液样品。②育雏期采样：对刚出壳0日龄雏山鸡，随机抽取20羽苗雏采血；以后每隔10 d随机抽取20羽雏山鸡采取血样，共采集0日龄、10日龄、20日龄、30日龄等4个批次、80份血样。由于雏山鸡体型偏小，此期采血可取心脏采血的方法或直接颈动脉放血采样。③育成期及后续样品采集：试验山鸡在转群至育成期饲养后的第60日龄时随机采取20份血样，以后每隔30 d在试验山鸡群中随机采取20份血样，共采集60日龄、90日龄、120日龄、150日龄和180日龄等5个批次共100份育成期青年山鸡的血样；种山鸡开产后分别采取210日龄、240日龄、270日龄、300日龄和330日龄等5个批次、100份种山鸡血样。④样品处理与保存：整个试验共采集试验山鸡14个批次、280份血液样品和43周龄种母山鸡1个批次、20份血液样品，总数为15个批次、300份血液样品；每个批次样品在采集后立即分离血清，标记后冷冻保存；至全部15个批次血样全部采集完成后集中监测。

(4)样品检测。①抗体检测：按照国标(GB/T 18936-2003)《H9N2亚型禽流感诊断技术》中血凝和血凝抑制试验的方法进行操作。②评定标准：所有300份血清样品在同一时间采用血凝抑制试验(HI)同步进行H9N2亚型禽流感抗体检测；HI滴度效价≥4 log2判为抗体合格。

2 结果与分析

2.1 结果

(1)种母山鸡抗体检测结果。种母山鸡43周龄1个批次的20份血样，采用HI方法检测，HI均值为9.0log2,检测结果分类汇总见表2。

表2 种母山鸡20份样品HI方法检测结果分类汇总表

(2)试验山鸡抗体检测结果。试验山鸡14个批次共280份样，采用HI方法同时检测，各批次HI平均值汇总结果见表3和图1。

表3 试验山鸡14个批次免疫抗体HI均值

图1 试验山鸡14个批次样品免疫抗体HI均值折线图

(3)试验山鸡抗体阳性合格结果。14批次280份试验山鸡血样的抗体阳性合格率汇总结果见表4和图2。

表4 试验山鸡14个批次样品免疫抗体阳性合格率汇总表

图2 试验山鸡14个批次样品免疫抗体阳性合格率折线图

2.2 分析

(1)种母山鸡抗体检测结果分析。分析表2发现：种母山鸡20份血样的HI值全部合格，且平均值达9.0log2，其中HI值大于8log2有19份，说明种母山鸡的H9亚型禽流感免疫抗体水平较高，可有效保护群体抵御野毒侵袭。

(2)试验山鸡母源抗体分析。分析表3和图1可以看到：0日龄样品的H9抗体检测HI均值高达8.45log2，说明试验山鸡较好地获得了亲本的母源抗体，而且在随后的10、20、30日龄等三批样品的母源抗体也一直维持在6log2以上的较高抗体水平，可较长时间有效保护试验山鸡在育雏期免受野毒侵袭。

(3)试验山鸡免疫抗体分析。33日龄采用H9N2亚型灭活疫苗首免后，试验山鸡抗体水平快速提升至12 log2，并随着69日龄和125日龄的二次加强免疫，试验山鸡的抗体水平持续升高，并在150日龄时达到14.25log2的高峰值，且维持时间较长，在240日龄时的抗体HI均值仍达到10.25log2。

但在270日龄时试验山鸡的免疫抗体有一个异常反弹，HI均值达到了13.55log2，比上一批样品的HI均值提高了3.3个

数量级，而此期试验山鸡未开展任何相关免疫，鸡群也未见任何异常。提示试验鸡群可能受到H9亚型禽流感的野毒侵袭，但由于群体高水平的免疫抗体有效保护了试验山鸡免受损害。

(4)试验山鸡抗体阳性合格率结果分析。分析表4发现，在本次试验山鸡14个批次280份样品的H9亚型禽流感抗体HI检测结果中，仅有3份样品的抗体水平为阴性，其它均为阳性合格样品，阳性合格率达到了98.8%。说明试验山鸡H9亚型禽流感的群体免疫水平很高。其中3份不合格样品均在育雏期，分别是10日龄批次2份、30日龄批次1份，这是母源抗体消退后的正常现象。在33日龄首免后，所有样品均达到阳性合格标准，且抗体水平远超5log2的临界值。从图2可以看到，在10日龄和30日龄有二个较小的低谷值外，整个试验期其他批次的抗体阳性合格率均为100%的高峰值。

3 讨论

(1)试验结果证明：H9亚型禽流感母源抗体有较好的遗传性，亲本种山鸡的高水平抗体可较好地遗传给子代并在育雏期内得到有效保护。

(2)H9亚型禽流感灭活疫苗对山鸡具有较好地免疫源性，

实施免疫后的抗体上升快、效价高、维持时间长。

(3)根据本次试验的相关结果，建议在生产实践中，可适当延后H9亚型禽流感灭活疫苗的首免时间，并减少一次加强免疫。推荐免疫程序见表5。

表5 H9亚型禽流感推荐免疫程序

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