莲心碱对LPS诱导小鼠急性肺损伤的保护作用

陈朝阳，姚茹，王璐，王晨阳，郭民，宋国华，张锐虎

(山西医科大学实验动物中心；实验动物与人类疾病动物模型山西省重点实验室，太原　030001)

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是各种因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成以肺实质弥漫性炎症为特征的呼吸疾病[1]。研究报道，炎症介质和氧化应激介导的肺组织损伤是ALI发病的主要机制[2]。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，是革兰阴性细菌细胞壁的成分，也是细菌内毒素的主要成分，能够激活单核吞噬细胞系统，促使促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)的释放，激活中性粒细胞，产生髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和炎症介质氧自由基，导致肺组织发生炎症反应和氧化应激[3-4]。活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)产生过多，可抑制氧自由基清除剂超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)等酶的活性，损伤肺组织造成ALI的发生[5]。因此，寻求抑制氧化和炎症靶点的药物对ALI防治具有重要作用。

莲心碱(liensinine, LIE)，是从中草药莲子心中提取的一种双苄基四氢异喹啉类生物碱[6]。余万桂等[7-8]研究了莲心碱对大鼠脑缺血再灌注的影响，发现莲心碱能够改善脑神经功能障碍，缩小脑梗死面积，增强抗氧化物酶SOD、GSH的活性，减少炎性因子TNF-α的表达,由此可推测莲心碱可能既具有抗氧化又具有抗炎症的作用。因此，本研究通过建立LPS诱导的急性肺损伤模型，探讨莲心碱对ALI的抗炎、抗氧化保护作用。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1实验动物

6～8 周SPF雄性BALB/c小鼠72只，20～22 g，由山西医科大学实验动物中心提供【SCXK(晋)2015-001】，动物实验在该中心屏障动物实验室中进行【SYXK(晋)2015-001】。实验期间动物给予自由饮食。饲养环境的温度为20～24℃，相对湿度控制在40%～70%，明暗各12 h交替。本实验操作符合实验动物伦理学要求(伦理审批号：IACUC2017-007)。

1.1.2药物与试剂

莲心碱购自北京中科质检生物有限公司，批号：2586-96-1；LPS、Evans blue购自美国Sigma公司；瑞氏吉姆萨染色购自TNF-α、IL-6、IL-1βELISA试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司。ROS、SOD、GSH、MPO试剂盒购自南京建成有限公司。

1.1.3仪器

轮转切片机(RM2235，Leica公司,德国)，倒置显微镜(BX51，Olympus公司，日本)，流式细胞仪(FACS-Calibur，BD公司，美国)，微孔分光光度计(Epoch，Biotek公司，美国)，高速微量离心机(3-18k，Sigma公司，美国)，电热恒温水浴锅(HH-2，北京科伟永兴仪器有限公司)。

1.2　方法

1.2.1构建小鼠急性肺损伤模型

将72只小鼠随机分为六组，正常对照组、模型组(LPS)、莲心碱(2、4、8 mg/kg)组、地塞米松(dexamethasone，DEX，5 mg/kg)组，每组12只。小鼠禁食12 h后，分别尾静脉注射生理盐水、莲心碱和地塞米松。给药1 h后，戊巴比妥钠麻醉小鼠，将LPS滴注入小鼠鼻孔中(10 μg LPS，用50 μL PBS溶解)，正常组小鼠鼻孔内滴注50 μL PBS[9]，12 h后牺牲小鼠。

1.2.2收集支气管肺泡灌洗液和相应指标检测

小鼠处死后，暴露气管并将导管插入气管，用1 mL注射器抽取0.5 mL PBS进行灌洗，灌洗3次收集支气管肺泡灌洗液(BALF)[10]。取一部分BALF采用BCA蛋白试剂盒检测蛋白含量，其余BALF迅速4℃、1400 r/min、10 min离心，取上清液置-20℃冻存,按照ELISA试剂盒说明书方法分别检测炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量，离心后的沉淀用于细胞分类计数，采用瑞氏吉姆萨(Wright-Giemsa)染色法进行细胞涂片。

1.2.3肺毛细血管通透性检测

处死小鼠前15 min每组取6只，按2 mL/kg经尾静脉注射2%的伊文思蓝后处死小鼠，处死时立即抽取左心室血液，用针头刺入右心室，生理盐水冲洗肺血管至冲洗液澄清为止，取肺组织放入1 mL/100 mg的甲酰胺溶液中浸泡，50℃隔水式培养箱温育24 h，提取伊文思蓝渗出液在分光光度计620 nm下检测吸光度，通过标准曲线计算伊文思蓝含量[11]。

1.2.4病理组织的观察

取右肺上叶置4%的中性甲醛中固定24 h，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片4 μm，烤片，脱蜡，HE染色，脱水透明，封片。

1.2.5匀浆组织中MPO、MDA、SOD、GSH的检测

取右肺下叶，液氮研磨后，加入PBS制成匀浆组织，漩涡振荡并3 000 r/min离心10 min，取上清液按照试剂说明书分别进行MPO、MDA、SOD、GSH的检测。

1.2.6肺组织中ROS的检测

取左肺组织，用研磨棒边研磨边以PBS冲洗，收集细胞悬液于300 μm尼龙网过滤，PBS重悬后细胞计数不少于106细胞个/mL。每组样品加入10 μmol/L的荧光探针 DCFH-DA，37℃孵育30 min，1400 r/min离心10 min，用PBS洗涤2次后收集细胞沉淀物，加入200 μL binding buffer用流式细胞仪进行检测，结果以平均荧光强度值(每个细胞含有的荧光强度)表示。

1.3　统计分析

2　结果

2.1　各组小鼠急性肺损伤的病理学改变

HE染色结果显示，正常对照组肺组织无明显病理学改变；LPS组可见明显的炎性细胞浸润，支气管肺泡壁增厚和肺充血；莲心碱组可见炎性细胞和支气管肺泡壁厚度的减少，肺充血现象的减弱，随着莲心碱浓度的增加，抑制作用越明显；地塞米松组基本可改善肺组织损伤至正常对照组的病理改变(见图1)。

注：A.对照组；B.LPS组；C.莲心碱组(2 mg/kg)；D.莲心碱组(4 mg/kg)；E.莲心碱组(8 mg/kg)；F.地塞米松组(5 mg/kg)。图1　各组小鼠急性肺损伤的病理学改变(HE, ×100)Note. A. Control group. B. LPS group. C. LIE group(2 mg/kg). D. LIE group(4 mg/kg).E.LIE group(8 mg/kg). F.DEX(5 mg/kg).Fig.1　Pathological changes of acute lung injury in the mice in each group (HE staining, ×100)

2.2　各组BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的比较

ELISA检测结果显示，LPS组BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量明显高于正常对照组，而莲心碱组和地塞米松组均低于LPS组，且莲心碱呈剂量依赖性抑制关系，差异有显著性(P< 0.05)(见表1)。

2.3　各组细胞计数和MPO活性的比较

Wright-Giemsa染色涂片结果显示，LPS组BALF中中性粒细胞数明显高于正常对照组，而莲心碱组和地塞米松组均低于LPS组，且莲心碱呈剂量依赖性抑制关系，差异有显著性(P< 0.05)。匀浆组织中MPO活性的检测结果，LPS组MPO的活性明显高于正常对照组，而莲心碱组和地塞米松组MPO的活性显著低于LPS组，且莲心碱呈剂量依赖性抑制关系，差异有显著性(P< 0.05)(见表2)。

2.4　各组BALF中的蛋白浓度和肺毛细血管通透性的比较

BCA试剂盒检测BALF中的蛋白浓度结果，LPS组的蛋白浓度明显高于正常对照组，而莲心碱组和地塞米松组均低于LPS组，且莲心碱呈剂量依赖性抑制关系，差异有显著性(P< 0.05)。Evans Blue染色结果显示，LPS组伊文思蓝含量显著高于正常对照组，而莲心碱组和地塞米松组的伊文思蓝含量均低于LPS组，且莲心碱呈剂量依赖性抑制关系，差异有显著性(P< 0.05)(见表3，图2)。

表1　各组BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的比较Tab.1　Comparison of the contents of TNF-α, IL-6, IL-1β in the BALF of each

注：与对照组比较，#P< 0.05，##P< 0.01；与模型组比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.#P< 0.05,##P< 0.01, compared with the control group;*P< 0.05，**P< 0.01, compared with the LPS group.

表2　各组BALF中的中性粒细胞数和MPO活性的比较Tab.2　Comparison of the number of neutrophils and the activity of MPO in BALF of each

注：与对照组比较，#P< 0.05，##P< 0.01；与模型组比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.#P< 0.05,##P< 0.01, compared with the control group;*P< 0.05，**P< 0.01, compared with the LPS group.

2.5　各组MDA含量、SOD活性、GSH含量和ROS平均荧光度值的比较

肺匀浆组织中MDA、SOD、GSH的检测结果显示，与正常对照组比较，LPS组匀浆上清中的SOD活力和GSH含量明显减少，MDA含量增多，差异有显著性(P< 0.05)，而莲心碱组和地塞米松组可以增加SOD活力和GSH含量，减少MDA含量，且呈剂量依赖性抑制关系，与LPS组相比，差异有显著性(P< 0.05)；流式细胞术检测结果显示，LPS组波峰明显比正常对照组右移，肺组织中ROS的平均荧光度值高于正常对照组，而莲心碱组和地塞米松组的波峰均向左移，平均荧光度值均低于LPS组，差异有显著性(P< 0.05)(见表4，图3)。

表3　各组BALF中的蛋白含量和肺组织中伊文思蓝渗出液的比较Tab.3　Comparison of the protein contents in BALF and the Evans blue labeled albumin extravasation in the lung

注：与对照组比较，#P< 0.05，##P< 0.01；与模型组比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.#P< 0.05,##P< 0.01, compared with the control group.*P< 0.05，**P< 0.01, compared with the LPS group.

注：A. 对照组；B. LPS组；C. 莲心碱组(2 mg/kg)；D. 莲心碱组(4 mg/kg)；E. 莲心碱组(8 mg/kg); F. 地塞米松组 (5 mg/kg)。图2　肺组织伊文思蓝染色Note. A. Control group. B. LPS group. C. LIE group (2 mg/kg). D. LIE group (4 mg/kg).E. LIE group (8 mg/kg). F. DEX group (5 mg/kg).Fig.2　Evans blue-labeled albumin extravasation in the lung tissues

组别 GroupsMDA含量(nmol/mgprot)MDA content(nmol/mgprot)SOD活性(U/mgprot)SOD activity (U/mgprot)GSH 含量(μmol/gprot)GSH content (μmol/gprot)ROS平均荧光强度值ROS mean fluorescenceintensity(MFI)对照组Control group1.05±0.01123.00±1.00503.66±0.0187.72±1.00LPS组 LPS group 3.98±0.01##71.00±1.10##177.33±2.51##234.63±20.00##莲心碱组 LIE group (2 mg/kg)1.65±0.01**82.20±1.36**353.66±3.51**178.79±17.00**莲心碱组 LIE group (4 mg/kg)1.49±0.01**87.30±0.60**388.00±2.64**120.11±8.50**莲心碱组 LIE group (8 mg/kg)1.42±0.01**88.20±1.05**405.00±4.00**110.15±8.00**地塞米松组DEX group1.35±0.01**110.13±1.20**411.00±6.55**105.25±5.00**

注：与对照组比较，#P< 0.05，##P< 0.01；与模型组比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.#P< 0.05,##P< 0.01, compared with the control group.*P< 0.05，**P< 0.01, compared with the LPS group.

注：A.对照组；B.LPS组；C.莲心碱组(2 mg/kg)；D.莲心碱组(4 mg/kg)；E.莲心碱组(8 mg/kg);F.地塞米松组(5 mg/kg)。图3　流式细胞术检测的各组肺组织中ROS的平均荧光强度Note. A. Control group. B. LPS group. C. LIE group (2 mg/kg). D. LIE group (4 mg/kg).E. LIE group (8 mg/kg). F. DEX group (5 mg/kg).Fig.3　The mean fluorescence intensity of ROS in the lung tissues of each group detected by flow cytometry

3　讨论

研究报道，急性肺部炎症时会出现中性粒细胞浸润、炎症细胞因子增加和蛋白质的渗出[12]。过量的活化的中性粒细胞会产生促炎细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β，同时中性粒细胞的浸润导致肺微血管通透性增高，血浆蛋白质渗入肺间质，造成肺水肿[4]。本研究成功构建了LPS鼻腔滴入诱导的急性肺损伤小鼠炎症模型，HE染色结果显示，莲心碱和地塞米松均可改善LPS诱导的炎性细胞浸润、支气管肺泡壁增厚和肺充血等病理改变。肺组织中MPO的活性是中性粒细胞浸润的重要指标，中性粒细胞浸润情况结果显示，莲心碱和地塞米松均可降低中性粒细胞数和MPO的活性。ELISA检测结果显示，莲心碱和地塞米松均可降低BALF中促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。伊文思蓝可与白蛋白结合，用来测定肺微血管通透性，从而反应蛋白质的渗出情况，本结果显示，莲心碱和地塞米松均可降低蛋白的渗出，降低肺微血管通透性，抑制肺水肿的形成。以上实验数据表明，莲心碱能有效减轻LPS诱导的ALI的炎症反应。

研究报道，氧化应激和氧自由基的过多产生在ALI的发生和发展中起重要作用[13]。LPS可诱导肺组织中大量中性粒细胞的积聚，致促炎细胞因子的释放和ROS产生的增多，引起氧化应激，过量的ROS可引起细胞和亚细胞器膜的脂质过氧化，促使脂质过氧化产物MDA的增多，对细胞结构和功能造成严重损害，损伤肺组织致ALI，而自由基清除剂SOD、GSH可以消除氧自由基和MDA[14]。研究报道，莲心碱对高脂血症大鼠可提高显著的GSH含量和SOD活性，表明莲心碱的抗氧化活性[15]。本实验结果显示，LPS可诱导肺组织中大量ROS的产生且能够显著降低肺组织中SOD活性和GSH含量，这与ALI患者的相应指标变化一致[16]；而给予莲心碱和地塞米松，ROS的平均荧光强度值降低，SOD活性和GSH含量均升高。以上实验数据表明，莲心碱能有效减轻LPS诱导的ALI的氧化应激损伤。

本研究证实了莲心碱可以通过减轻肺水肿和血管渗漏，改善肺组织的病理变化和氧化应激损伤，减少中性粒细胞的浸润和BALF中炎性细胞因子的释放，对急性肺损伤起保护作用，具体的抗炎抗氧化作用机制需进一步深入研究。