甘油浓度与冷冻速率对鸡细管冻精质量的影响

阳小胡，孙 鏖，贾杏林，朱立军，蒋桂韬，燕海峰，3*

(1.湖南省畜牧兽医研究所，湖南 长沙 410131；2.湖南农业大学 动物医学院, 湖南 长沙 410125；3.湖南佳牛牧业科技有限公司，湖南 长沙410131)

甘油细管冷冻是两类主要的精液冷冻技术之一[1-4]，甘油作为冷冻保护剂的浓度研究较多，一般都超过了8%(v/v)，最常用为11%[5-7]。 研究表明，低浓度的甘油作为鸡精液冷冻保护剂，解冻后精子活力与活率随着浓度的降低而降低，但受精率却在一定浓度范围内有所升高[4-5,8]；甘油浓度分别为4%、6%、7%、8%时的受精率相差不大，在23%～30%之间[5]；使用13%甘油冻精解冻后活力和复苏率均显著高于10%和15%，且极显著高于4%和7%[9]，说明不同研究得出的合适甘油浓度不一定相同。

冷冻速率也是精液冷冻技术的关键步骤，主要包括程序冷冻仪(控制样品室中喷入的液氮量)[4-5]与液氮熏蒸(控制样品离液氮面的高度)来实现，后者因装置简单廉价而被广泛采用。冷冻速率主要是一步[10-12]与两步冷冻法(5～-35 ℃慢速冷冻与-35～-150 ℃快速冷冻)[4-5,13]。

液氮熏蒸技术方面，大部分采用一步冷冻法，用聚苯乙烯泡沫箱将0.5 mL甘油(浓度为11%)细管精液放入液氮面6.4 cm处熏蒸10 min(-10 ℃/min)后浸入液氮，通过输卵管手术输精后收集2～8 d种蛋获得了69%～77%受精率。

Rakha等[10]、Han等[11]和Blanco等[12]分别对二甲基亚砜、20%甘油和肉毒碱对鸡精液冷冻效果进行了研究。但是以上研究主要采用单因素分析法，无论是甘油浓度、冷冻速率还是其它因素，优化出的结论差异较大。不同品种或个体在特定的冷冻方法与条件下，适合特定的甘油浓度、冷冻和解冻方法[5,8,10,14-15]，甘油浓度、冷冻速率、鸡品种等多个关键步骤之间还很有可能存在互作关系，这也许就是精液冷冻技术不稳定的原因。本试验用不同甘油浓度、冷冻速率与母鸡品种，液氮熏蒸技术(发明专利ZL201210105884.8)对鸡细管精液冷冻技术进行研究，为其推广应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

公鸡为黑丝羽乌骨鸡，母鸡为白莱航与伊萨鸡，由湖南省畜牧兽医研究所饲养。其它试验材料等同文献[11]。

1.2 试验设计

1.2.1 浓度与冷冻速率及其互作对甘油细管冻精活力影响 试验采用5×9 (甘油浓度×冷冻速率)的随机化试验设计，2%、4%、6%、8%、11% 等5组甘油浓度水平，冷冻速率分为1～9组9个冷冻速率水平(水平铺放1～9高度处细管，间隔1 cm)，以解冻后精子活力为判断指标进行分析，试验重复3次，设3个平行样。

1.2.2 不同甘油浓度冻精以及母鸡品种对孵化效果影响 将同浓度2～8高度处细管冻精解冻后混合，记录解冻后活力、离心去甘油后活力，以及输精后的孵化效果进行比较。4%、6%、8%、11%甘油浓度组采用80只(每组20只)30周龄白莱航母鸡，连续重复冷冻试验并输精7次。

在以上试验结束后，2%甘油浓度组采用90只母鸡(60只30周龄白莱航母鸡和30只20周龄伊莎母鸡)，连续重复冷冻试验并输精2次。其中，白莱航鸡数据部分纳入4%～11%组进行统计，得出同品种不同浓度甘油对孵化效果影响的数据；其中莱航鸡与伊萨鸡数据，用于比较相同公鸡与甘油浓度，不同品种母鸡对孵化效果影响的结论。

1.3 试验方法

1.3.1 稀释液的配制 3种稀释液分别为YD1、YD2与YD3(见表1)，分别用于稀释、离心、冷冻，离心后沉淀重悬用YD1液。稀释液的pH在7.0～7.4，渗透压在380～420 mOsm/kg。过滤灭菌，-20 ℃保存，其中YD3液中的甘油在使用前添加。

表1 3 种稀释液溶质成份表Table 1 The solute composition table of three kinds of dilutions

1.3.2 精液的采集、稀释与活力检测 解冻YD1(20 mL)、YD2(30 mL)与YD3(10 mL)液，根据甘油终浓度分别为2%、4%、6%、8%、11%，配制好浓度分别为4%、8%、12%、16%、22%的YD3稀释液，存于5 ℃。

采用背腹部按摩双人采精法，用5 mL离心管采集4 mL精液后，分装到2个10 mL离心管中，按原精与YD1液1∶1比例进行等温稀释，存于5 ℃保温箱中尽快带回实验室。取12 μL精液在32 ℃恒温板液晶显示屏显微镜(物镜20×)下，按9级活力等级标准，活力低于0.7的精液不采用。检查完活力后于5 ℃冰箱中平衡30 min。

1.3.3 甘油的添加 将2管稀释后的精液分装在5个5 mL离心管中，每管2 mL，分别添加2 mL (1∶1)浓度为4%、8%、12%、16%、22%的 YD3液，得到甘油终浓度分别为2%、4%、6%、8%、11%，存于5 ℃平衡10 min。

1.3.4 甘油细管冻精制作 将在5 ℃平衡后的精液摇匀，把细管远离棉塞的一端插入，轻轻吸精液至9/10体积(4 mL精液可做0.25 mL细管约16支)。再将远离棉塞的一端轻轻插入封口粉中数次，直到细管中进入约3 mm高度的粉末。采用专利简易便携式冷冻器，将细管置入细管架的1～9高度处(每高度间隔为1 cm)。选用保温与密封性较好的液氮容器，每次试验倒入液面离箱底高度为7 cm左右的液氮。

1.3.5 细管精液的冷冻、解冻与活力检测 两步法冷冻：第1步为细管架底部距离液氮面17 cm处熏蒸4 min(冷冻速率约为-14～-9 ℃/min)；第2步用15 s 时间将细管架缓慢降落到液氮表面，浮在液氮面熏蒸2 min (冷冻速率约为-60～-25 ℃/min)，再浸入液氮。一段时间后，将细管从液氮里拿出，快速浸入5 ℃的水中，解冻3 min，检测解冻后精子活力。

1.3.6 去甘油及活力检测 解冻后的样品放于5 ℃冷藏箱中，按解冻后精液和YD2液比例为1∶2(v/v)，分6次添加，每次加入稀释液间隔时间为2 min，如解冻后精液体积为1 mL，则加入稀释液的体积依次为35 μL(1∶0.035)、90 μL(1∶0.09)、165 μL(1∶0.165)、300 μL(1∶0.3)、620 μL(1∶0.62)和790 μL(1∶0.79)，所添加的YD2液总体积为2 mL。经以上步骤处理的精液以600×g在5 ℃的冷冻离心机上离心10 min，弃上清；添加解冻后精液等体积的YD1液重悬沉淀，检测活力。样品存放于5 ℃冷藏箱中，30 min内进行人工输精。

1.3.7 解冻精液输精效果检测 用左手挤压母鸡泄殖腔露出同心圆后，用1 mL去针头注射器慢慢旋转进入鸡阴道约4 cm后松开左手，每只母鸡输精量约为4.0×108个精子，每72 h输1次，首次输精后第3天开始捡蛋，最后1次输精后第6天停止捡蛋，每3 d入孵1批，孵化至第7天检测受精率，孵化21 d统计入孵蛋出雏率。

1.4 数据分析

数据经Excel软件处理后，采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析与显著性检验。使用一般线性模型(GLM)进行两因子单变量方差分析，主效应包括甘油浓度、冷冻速率及二者间的交互效应，以P<0.05为显著水平，P<0.01为极显著水平。用Duncan's 法进行多重比较，试验结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 不同甘油浓度冻精解冻后的活力

以甘油浓度为主效应，浓度最低的2%组，各高度均显著低于其它各浓度组(P<0.05)，而11%浓度组，则在各高度均显著高于2%～6%浓度组(P<0.05)，8%～11%各组间差异不显著(P>0.05)，11%组效果最优(表2)。

2.2 不同高度冻精解冻后的活力

以冷冻高度(冷冻速率)作为主效应，发现高度不能太高也不能太低，尤其是在甘油浓度较低时更明显，如2%浓度组，第1～5高度、第9高度没有显著差异，显著低于6～8高度的(P<0.05)，6～8高度之间差异不显著(P>0.05)，综合来看，第6高度效果最佳(表2)。

甘油浓度-冷冻速率对鸡细管精液冷冻效果有非常强的交互作用，甘油浓度-冷冻速率交互作用下“浓度”、“速率”、“浓度-速率”对活力有极显著的影响(P<0.01)。浓度越低对冷冻高度越敏感，浓度最低的2%组，6个高度显著低于较好的3个高度(6～8)(P<0.05)；浓度越高，对冷冻高度的适应性越宽，浓度最高的11%组，各组高度的活力均很好，没有显著差异(P>0.05)(表2)。

表2 不同甘油浓度冻精解冻后的活力(n=3)Table 2 The motility of thawed semen frozen by different glycerol concentration (n=3)

注：同列字母不同表示差异显著(P<0.05)，字母相同表示差异不显著(P>0.05)。

Note: The different lowercase superscripts in the same column mean significant difference (P<0.05), otherwise means no significant difference (P>0.05).

2.3 不同甘油浓度冻精解冻后及去甘油后活力

就整体趋势而言，去甘油前活力与去甘油后活力成正相关，但6%组去甘油前其与4%、8%、11%组的精子活力无显著差异(P>0.05)，但去甘油后与4%、8%组有显著差异(P<0.05)。去甘油后比去甘油前，精子活力下降基本超过50%(表3)。

2.4 不同甘油浓度对冻精受精率及出雏率的影响

从表4可知，6%甘油浓度组的受精率最高，与4%、8%组差异不显著(P>0.05)；2%组的最低，与其它各组有显著性差异(P<0.05)；4%、6%、8%组之间无显著性差异(P>0.05)；11%组显著低于4%、6%、8%组(P<0.05)，但出雏率与8%组无显著差异(P>0.05)。

表3 不同甘油浓度组去甘油前后精子活力(n=7)Table 3 The sperm motility before and after glycerol removal in different glycerin concentration groups (n=7)

注：同行字母不同表示差异显著(P<0.05)，字母相同表示差异不显著(P>0.05)。

Note: The different lowercase superscripts in the same row means significant differences (P<0.05), otherwise means no significant difference (P>0.05).

表4 不同甘油浓度对冻精孵化效果的影响Table 4 The hatchability of thawed semen frozen by different glycerol concentration

2.5 不同甘油浓度对冻精最后一次输精后受精率的影响

由图1可见，连续输精最后一次输精后的第2～11天捡蛋，各浓度组受精率呈逐渐下降趋势，但也有例外的时间点。4%、8%、11%浓度组，均为第3天受精率最高(分别为94.12%、93.75%、85%)，到第11天受精率最低(分别为31.58%、23.08%、18.52%)。6%浓度组第5天受精率最高(71.43%)，到第11天受精率最低(为12.50%)。整体而言，6%浓度组的受精率要低于其它组。

2.6 2%甘油浓度对不同品种母鸡的受精率与出雏率的影响

用黑丝羽乌骨鸡冻精对白莱航鸡和伊萨鸡母鸡进行人工输精，受精率和出雏率都无显著性差异(P>0.05)，白莱航鸡略高于伊萨鸡(表5)。

图1 不同甘油浓度冻精连续输精后最后一次输精的受精率Fig. 1 The hatchability of thawed semen frozen bydifferent glycerol concentrations and theeggs were collected after the last insemination

3 讨 论

3.1 甘油浓度对鸡冻精效果的影响

本试验采用从2%增加到11%甘油浓度做细管精液，解冻精子活力逐渐升高，体现出了这种保护作用，但受精率最高的却不是浓度最高组，其中4%～6%甘油的受精率都比较高，而浓度在8%以上则都变差，这与国内外报道一致[4-5，9]，原因可能是甘油浓度越大，尽管在冷冻损伤方面保护效果好，但由于甘油的添加与去除会在极短时间段内导致精子环境的渗透压发生巨大的变化，虽然采用了分步并间隔一定时间添加清洗液来减少这种伤害，减缓精细胞内进入水分子的速度，但甘油浓度越大对精细胞膜和各细胞器的物理损伤也越大，所以受精能力可能会变差。

表5 2%甘油浓度冻精对伊萨和白莱航鸡的受精率和出雏率的影响Table 5 The hatchability of Issa and White Leghorn hens inseminated with thawed semen frozen with 2% glycerol concentration

本研究中，去甘油中稀释清洗比例为1∶2，在11%甘油浓度基础上优化出来，而稀释清洗的最佳比例也可能随着甘油浓度变化而变化，不同甘油浓度的最佳清洗比例还有待进一步研究。本研究4%甘油浓度组在最后一次输精后的2～11 d的受精率最高，而在各浓度连续多次输精情况下却是6%浓度组受精率最高，二者不一致，原因还有待进一步研究。由于试验母鸡数量有限，本研究首先设计了4%～10%甘油浓度组，后来又单独进行了2%浓度组的试验，但从数字上看2%浓度组受精率最低，一方面可能是浓度低于一个下限，对精子保护作用就会很弱，另一方面2%甘油组是在其它4组试验结束后进行，母鸡年龄变大，且只进行了连续2次输精，如果条件与其它4组一样，受精率可能会更高。

鸡精液冷冻损伤的判定依据主要是形态结构、DNA完整性、活力与孵化率等指标。扫描电镜和透射电镜观察精子冷冻前后的形态结构变化发现，鲜精的顶体完整、边缘整齐、轮廓清楚，顶体膜、质膜表面平滑，冷冻精子解冻后虽然还有0.8以上的活力，但是有正常形态、正常超微结构的精子分别只有鲜精的14.3%和12.5%[9]，但该结论是在没有去掉甘油的情况下得出的，因此这些损伤可能不仅仅是冷冻所致，也可能是没有去掉甘油的原因，同时也说明在甘油作为冷冻保护剂时，不能仅凭活力作为筛选条件，要考虑去甘油后活力和受精率。由于精子冷冻步骤优化牵涉的检测工作量非常大，同时活力与孵化指标始终是两个最实用的评价参数，本研究将二者相结合，前者作为实验室的评价方法，后者作为生产实践的检测指标，也是最有说服力的指标，取得了良好效果。

3.2 鸡甘油细管精液冷冻速率与甘油浓度的相关性分析

对于冷冻速率与冷冻保护剂浓度的优化，一般采用单因素分析，先固定一个因素，再优化另一个。在禽类甘油细管精液冷冻领域，还未检索到甘油浓度与冷冻速率等多因素试验设计分析互作效应的报道。由于本文采用了专利技术，即利用了离液氮面不同距离熏蒸具有不同冷冻速率的原理，以及细管水平多个高度铺放架结构，在一批样品冷冻时，同一冷冻室能够获得不同冷冻速率的功能，实现了冷冻速率与其它参数互作效应的研究分析。

本研究采用了前期筛选出的两步冷冻法(液氮面17 cm处熏蒸4 min，细管架浮在液氮表面2 min)，得到了很好的效果，并发现甘油浓度-冷冻速率交互作用下“浓度”、“速率”、“浓度-速率”对活力有极显著的影响，为今后冷冻速率与其它影响因素的互作关系，以及针对特异性的品种与冷冻条件筛选冷冻方案提供了新思路。

3.3 不同鸡品种对冻精受精率的影响

国内外鸡冻精受精率报道差异很大，因为很多试验条件不同，公鸡母鸡品种不一样，冻精输精时可能存在某些母鸡在输卵管保留精子较其它个体强，有些公鸡精液的抗冻能力较强，最适甘油浓度等都可能不一样[10，14]；冷冻时由于不同品种和家系精子的理化性质有很大的不同，所以在家禽能够获得较好效果的冷冻方法在野生品种上不一定能够获得成功，精子在稀释、冷藏降温、平衡和冷冻过程中，对低温的耐受力因品种的不同而有很大的差异[15]；输精量和间隔时间不一样，连续输精次数、输精后捡蛋的天数以及孵化条件都不一样[5]，甚至很多报导的是一次输精的结果[10]。

本试验获得近几年鸡甘油细管精液冷冻报道的最高受精率，一方面可能是在本研究以及前期技术上的改进[13]，另一方面也可能是黑丝羽乌骨鸡公鸡的精子有较好的抗冻性，同时该结果是6%甘油浓度在泡沫架2～8高度所有细管的结果，如果只采用冷冻速率的最佳值，那么可能受精率会更高。此外，本研究一次输精与连续多次输精结果的趋势不一样，受精率和出雏率的方差还比较大等问题，还需要扩大母鸡群体，设计鲜精对照组等来深入研究冷冻技术、输精技术、鸡品种或个体差异等因素究竟是哪些导致了目前鸡精液冷冻的不稳定性。

4 结 论

通过黑丝羽乌骨鸡0.25 mL细管精液冷冻，两步液氮熏蒸法，从冻精活力判断甘油浓度与冷冻速率对鸡细管精液冷冻效果存在极显著互作关系，其最佳组合为11%浓度甘油+泡沫架第6高度；6%甘油浓度组获得高于近年来国内外文献报导的最高受精率；公鸡用黑丝羽乌骨鸡，母鸡用白来航鸡与伊莎蛋鸡，冷冻精液受精率没有显著差异。本研究为冷冻速率与其它影响因素的互作关系研究，以及针对特异性的品种与试验条件筛选冷冻方案提供了技术支撑。

参考文献:

[1] WOELDERS H, ZUIDBERG C A, HIEMSTRA S J. Animal genetic resources conservation in the Netherlands and Europe: poultry perspective[J]. Poultry Science, 2006,85:216-222.

[2] SASAKI K, TATSUMI T, TSUTSUI M, et al. A method for cryopreserving semen from Yakido roosters using methylacetamide as a cryoprotective agent[J]. Journal of Poultry Science，2010,47:297-301.

[3]SANTIAGO-MORENO J, CASTAO C, TOLEDANO-DAZ A, et al. Semen cryopreservation for the creation of a Spanish poultry breeds cryobank: optimization of freezing rate and equilibration time[J]. Poultry Science, 2011,90:2 047-2 053.

[4]ABOUELEZZ F M K, CASTANO C , SANTIAGO-MORENO J，et al. Effect of the interaction between cryoprotectant concentration and cryopreservation method on frozen-thawed chicken sperm variable[J] . Reproduction in Domestic Animals, 2015,50: 135-141.

[5] BLANCH E, TOMS C, CASARES L, et al. Development of methods for cryopreservation of rooster sperm from the endangered breed “GallinaValenciana de Chulilla” using low glycerol concentrations[J]. Theriogenology, 2014, 81(9): 1 174-1 180.

[6] LONG J A, BONGALHARDO D C, PELAEZ J,et al. Rooster semen crypreservation: Effect of pedigree line and male age on post thaw sperm function[J]. Poultry Science,2010, 89:966-973.

[7] MOCÉ E, GRASSEAU I, BLESBOIS E. Cryoprotectant and freezing-process alter the ability of chicken sperm to acrosome react[J]. Animal reproduction science. 2010, 122(3): 359-366.

[8] BLANCH E, TOMS C, CASARES L, et al. Effect of glycerol level on quality and fertilizing ability of cryopreserved rooster sperm[J]. Reproduction Domestic Animal, 2012,47(3):121.

[9] 胡艳娟,白银山，李莉，等. 鸡精液冷冻保存效果的研究[J]. 国外畜牧学:猪与禽, 2011,31(3):85-86.

[10] RAKHA B A, ANSARI M S, AKHTER S, et al. Cryopreservation of Indian red jungle fowl (Gallus gallusmurghi) semen[J]. Animal Reproduction Science. 2016,174:45-55.

[11] FATTAH A, SHARAFI M, MASOUDI R,et al. L-Carnitinein rooster semen cryopreservation: Flow cytometric, biochemical and motion findings for frozen-thawed sperm[J]. Cryobiology，2017，74:148-153.

[12] IAFFALDANO N, DI IORIO M, MIRANDA M,et al. Cryopreserving turkey semen in straws and nitrogen vapour using DMSO or DMA: effects of cryoprotectant concentration, freezing rate and thawing rate on post-thaw semen quality[J]. British Poultry Science, 2016 , 57(2):264-267.

[13] 阳小胡, 张佰忠，孙鏖,等. 鸡细管冻精去甘油技术研究[J]. 中国家禽, 2016(38):15-19.

[14] LONG J A, PHILLIP H, PURDY B, et al. Cryopreservation of turkey semen: Effect of breeding line and freezing method on post-thaw sperm quality, fertilization, and hatching[J]. Cryobiology, 2014, 68:371-378.

[15] BLANCO J M, LONG J A, GEE G, et al. Comparative Cryopreservation of avian spermatozoa: effects of freezing and thawing rates on turkey and sandhill crane sperm cryosurvival[J]. Animal Reproduction Science, 2012,131:1-8.