三氧化二砷对慢性粒细胞白血病Hedgehog信号转导通路分子蛋白表达的影响

马咏歌，宋鹏，叶向梅，赵辉，刘志宇，张丽坤，刚宏林,3，杨东光*(.黑龙江中医药大学， 黑龙江 哈尔滨 50040；.哈尔滨医科大学附属第一医院中心血液实验室，黑龙江 哈尔滨 5000；3.哈尔滨食品药品检验检测中心， 黑龙江 哈尔滨 5005)

三氧化二砷(Arsenic trioxide, ATO)，又名亚砷酸，为中药砒霜提取物，有剧毒，用于治疗慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)历史悠久，是最早的抗CML药物。Hedgehog(Hh)通路是胚胎发育过程中的关键信号通路之一，但是Hedgehog通路成分的改变往往与人类恶性肿瘤的发展有关[1]。研究表明Hh通路在部分CML患者中异常活化，CML的靶向性治疗药物伊马替尼(Imatinib mesylate,IM)对该通路无抑制作用，因此，该通路是IM耐药细胞赖以生存的重要信号转导通路。

目前，研究的Hh信号抑制剂均以Smoothened(Smo)为靶点，其药理活性较Smo的天然抑制剂环巴胺(Cyclopamine)有所提高，在治疗CML的临床前研究中获得了满意的疗效[2]。但作为新研发的小分子药物，在其走向临床之前，需要进行临床前研究以评价其安全性。其次， Smo抑制剂的应用诱发患者和鼠模型编码Smo蛋白的基因发生突变，这些突变严重阻碍了Smo抑制剂与该蛋白的结合能力，导致患者对该疗法耐药[3]。此外，Smo下游分子Gli2 和cyclin D1的直接活化，可以绕过Smo抑制剂的作用靶点，是Smo抑制剂耐药的另外一个原因[4]。所以，由于缺乏临床应用经验及以Smo为靶点，目前的Hh通路抑制剂尚无法在CML患者中广泛应用。

近年来随着医学水平的提高以及分子生物学的进展，ATO已经较为普遍地运用于肿瘤疾病的治疗上，并展现出较好的治疗效果。而且我们发现，ATO的应用可预防IM耐药的发生。ATO 在2010年被认定为Hh通路的靶向性抑制剂，我们率先在应用ATO治疗并获得满意疗效的急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)患者上进行了ATO对Hh通路抑制作用的验证。这为ATO应用于CML的IM耐药的治疗提供了理论上的可能性。但ATO对CML干细胞及其Hh通路的抑制作用及靶点尚未阐明。本研究以CML细胞株K562为模型，初步探讨ATO对CML细胞Hh通路关键蛋白表达的抑制作用及机制，为该药应用于CML的临床治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人类CML细胞株K562，为本实验室长期培养。ATO注射液(10 mg/10 mL)，由哈尔滨伊达药业提供。TRIzol，invitrogen公司。逆转录试剂盒，PROMEGA公司。Fast Start Universal SYBR Green PCR Master实时定量PCR试剂盒，罗氏公司。RIPA强裂解液，碧云天公司。抗c-Abl抗体(sc-56887)，Santa Cruz公司。碱磷显色二抗，Amersham公司。

1.2 方法

1.2.1 人类CML细胞株K562培养与处理

K562细胞使用含10%胎牛血清(杭州四季青)和浓度为100 IU/M青链霉素(Invitrogen)的1640培养基中(Gibco)，置于37℃细胞培养箱中长期培养。ATO注射液(10 mg/10mL)，由哈尔滨伊达药业提供。实验时，使用不同浓度的ATO溶液连续作用于K562细胞48 h，并收集细胞，做下一步检测。

1.2.2 Annexin-V/PI双染检测细胞调亡

收集经过浓度分别为0、1、2、4、8μM的ATO处理的K562细胞，经用PBS洗涤、AnnexinV-FITC染色后，在室温避光静止15 min后每管再加入1×binding buffer 400 μL，在1 h内上流式细胞仪进行凋亡检测。每份样品同设3份，求平均值和标准差。

1.2.3 免疫印迹

收集经过浓度分别为0、1、2、4 μM的ATO处理的K562细胞，采用RIPA强裂解液(150 mM NaCl, 1% w NP-40, 0.5%[w/v]sodium deoxycholate, 0.1%[w/v]sodium dodecyl sulfate (SDS), 50 mM Tris HCl [pH=8], 10 mM EDTA, and 1 mM PMSF)(碧云天)提取蛋白后进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，用蛋白转移装置将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，按转移蛋白的常规方法进行。转移结束后，进行免疫印迹、碱磷显色及灰度分析。采用抗体为抗Gli2抗体(C-10)(Santa Cruz)，抗Gli1抗体(Abcam)， 抗Smoothened抗体(Abcam)，抗Patched/PTCH 抗体(Abcam)and抗-actin抗体 (Santa Cruz)，及碱磷显色二抗 (Amersham)。

1.2.4 统计学处理

2 结果

2.1 ATO对K562细胞的诱导凋亡作用

经不同浓度的ATO处理后，CML细胞K562逐渐出现了凋亡现象，ATO诱导K562细胞出现凋亡呈药物剂量依赖性(见图1)。但值得注意的是，K562对ATO的敏感性较低，2 μM的ATO仅能诱导少量CML细胞发生凋亡。

图1 在48 h内不同浓度ATO诱导K562细胞凋亡效果

2.2 ATO对K562细胞Hh信号转导通路分子蛋白水平的影响

经不同浓度的ATO连续作用于K562细胞株48 h后，我们检测了K562细胞Hh信号转导通路分子的蛋白表达情况。结果发现，ATO 对Hh通路的核心蛋白Gli2蛋白表达具有显著的抑制作用，其抑制作用呈剂量依赖性(P<0.05)(见图2)。ATO对于Hh通路的抑制因子ptch2的表达具有一定的促进作用(高剂量呈抑制作用)，但无剂量依赖性(P>0.05)。但ATO对于Gli1蛋白，无论何种剂量，在48 h的作用时间内，均未对其蛋白表达水平产生显著的抑制作用(P>0.05)(见图3)。

图2 在ATO处理组和对照组中Gli2蛋白的表达情况注:与对照组比较，P<0.05

图3 在ATO处理组和对照组中ptch2、Gli1蛋白的表达情况注:与对照组比较，P>0.05

3 讨论

《本草图经》云:“砒霜，旧不着所出郡县，今近铜山处亦有之，惟信州者佳。其块有甚大者，色如鹅子黄，明澈不杂。此类本处自是难得之物，每一两大块，真者人竞珍之，市之不啻金价。古服食方亦或用之，必得此类，乃可入药。其市肆所蓄，片如细屑，亦夹土石，入药服之，为害不浅。误中，解之用冷水研绿豆浆饮之。”砒霜主要成分为三氧化二砷 (ATO)，白色，八面体状结晶，三氧化二砷加高热可以升华，故精制比较容易，升华物普通名砒霜。上世纪70年代哈尔滨医科大学创用“癌灵1号”(氧化砷注射液)治疗APL患者，说明砷剂对某些髓系恶性增殖性疾病有确切的疗效，含砷中药对白血病的治疗效果，再一次引起了国际肿瘤学界的关注[5]。ATO应用于临床治疗APL患者多年，现已被公认为是APL的标准治疗方案[6]。最近几年的研究表明，ATO具有广泛的抑瘤作用，不仅可以抑制恶性血液肿瘤细胞增殖，对于肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌等其他肿瘤细胞同样具有抑制作用[7-10]。

自2010年有学者发现ATO对Hh通路具有靶向性抑制作用以来，陆续有研究通过体内外实验证实，ATO通过此种机制对包括骨肉瘤、间皮瘤、恶性横纹肌样瘤、恶性胶质瘤、胰腺癌、成神经管细胞瘤和尤文肉瘤甚至APL在内的多种肿瘤发挥杀伤作用，而且ATO的作用范围不仅是肿瘤细胞，也包括部分肿瘤干细胞[11-15]。ATO对Hh信号转导通路表现出特异性抑制，该抑制作用与ATO的细胞毒性、ATO对Ras和Wnt通路的抑制和对JNK和Pp38MAPK通路的活化起作用均无关[13]。

研究发现，ATO对Hh信号转导通路的作用靶点为执行这条通路的核心蛋白Gli。ATO仅对Gli高表达肿瘤细胞具有较好的敏感性，而对Gli低表达的细胞株敏感性较差。目前推测ATO对Gli的作用机理为：Gli蛋白上存在与PML/RARα半胱氨酸残基相同的巯基结构，因此ATO能够与Gli蛋白结合并诱导其降解，体外研究已经发现，ATO长期作用能降解Gli2蛋白；并能与Gli1蛋白结合，抑制其靶基因Ptch和cyclinD1的表达[13-14]。此外，研究还发现，ATO短期作用还可以抑制Gli2在初级鞭毛的积累(该过程为Hh信号转导通路的关键步骤)，这可能是与ATO对微管的直接作用相关。

研究采用不同浓度的ATO处理CML细胞K562发现ATO对Hh通路核心蛋白Gli2的抑制和诱导细胞凋亡均呈药物剂量依赖性。但ATO的诱导凋亡效果落后于对Gli2抑制，ATO对Gli2的抑制作用开始于0.5 μM，该剂量对细胞的凋亡并未产生影响，当ATO浓度达到2 μM时，仅使少量CML细胞发生凋亡，但可使K562细胞的Gli2表达显著受抑。因此ATO对Hh分子的抑制，并非是细胞凋亡的后果，表明ATO对Gli2的抑制具有靶向性。本研究在K562细胞上发现ATO对Gli2的抑制作用，与文献报道的在其他细胞上ATO对Gli2的效果一致[13]。本研究还发现，ATO对K562细胞的Gli1蛋白并无抑制作用，该结果亦符合其他研究者的文献报道[14]。Hh通路的负反馈调控因子Ptch低表达是CML患者预后不良的标志，Ptch是预测IM治疗失败的敏感和特异性指标[16]。本研究发现，在ATO作用后，Ptch2蛋白的表达有升高的趋势，表明ATO可能是通过上调负调控因子的表达，抑制Hh通路。当ATO的浓度达到4 μM，大部分细胞死亡，Ptch2随之降解。

总之，本研究证实，在CML细胞中，ATO对Hh通路具有显著的抑制作用，主要是通过降解以Gli2为核心的蛋白发挥最用，并可一定程度上上调负调控因子Ptch2蛋白的表达。ATO对Hh通路的抑制作用具有特异性，发生在诱导凋亡之前。本实验为扩大ATO应用于IM耐药的CML提供了一个坚实的理论基础。

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