超声辅助提取尾叶香茶菜总二萜工艺研究

周天娇，李春燕,2，韩莉萍，李亚娟，吴艳芳*(．新乡医学院药学院，河南 新乡 453002；2.新乡医学院三全学院 药学综合实验室，河南 新乡 453003)

尾叶香茶菜Rabdosiaexcise(Maxim.)Hara属于唇形科香茶菜属的植物，全草入药，性凉、味甘，具有清热解毒、抗菌消炎、活血化瘀的功效。尾叶香茶菜主要含有萜类、黄酮类和挥发油等成分，其中萜类主要是对映-贝壳杉烷型二萜化合物，具有良好的抗肿瘤作用[1-4]。超声辅助提取可提高有效成分的提取速度和提取效率[5-6]，目前,此方法对二萜类化合物的提取有先例，但其影响因素并不齐全，本研究通过单因素试验和响应面试验多方面考察超声辅助提取尾叶香茶菜中二萜成分的提取工艺[7-13]，研究最佳的提取工艺条件，探索一种简便、快速、效率高的提取方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

尾叶香茶菜(2012年8月采集于吉林省磐石市，植物标本存在新乡医学院中药学标本馆)，对照化合物Kamebakaurin(从尾叶香茶菜中提取分离所得，纯度98%以上)，无水乙醇(分析纯)，蒸馏水(自制)。

KQ-600KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)台式低速自动平衡离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，L400)，电子天平(十万分之一，万分之一，XS205型，瑞士Mettler Toledo公司)，TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2 方法

1.2.1 标准品溶液的制备

取尾叶香茶菜二萜类化合物Kamebakaurin对照品适量， 精密称定，加70%乙醇溶解并制成每1 mL中含Kamebakaurin约0.2 mg的溶液，作对照品储备液，在-20℃下保存备用。

1.2.2 样品溶液的制备

取样品提取液0.1 mL，加70%乙醇定容至10 mL，以同样的方法在235 nm处测定其吸光度A，按回归方程计算总二萜含量。

2 结果和讨论

2.1 方法学研究

2.1.1 测定波长的选择

取对照品溶液，以70%乙醇为空白对照，在200～700 nm范围内进行扫描，在235 nm处有最大吸收，故选取235 nm为检测波长。

2.1.2 标准曲线的绘制

取对照品储备液，摇匀，分别精密量取0.50，0.60，0.80，1.00，1.50 mL置于10 mL容量瓶中，并用70%乙醇定容至刻度，摇匀，分别依法进样测定，记录色谱图，以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，计算线性回归方程为Y=22.446×-0.0088,r2=0.999 7，结果表明， Kamebakaurin在0.010～0.030 mg·mL-1范围内呈很好的线性关系。

2.1.3 精密度试验考察

取样品A3连续测定5次，记录吸光度值，RSD为0.77%，表明本方法精密度良好。

2.1.4 稳定性试验考察

将样品A3每隔10 min测定一次吸光度，连续测定6次，记录吸光度值，RSD为2.46%，表明样品溶液在1 h内较稳定。

2.1.5 加样回收率

精密称取已知总二萜含量的尾叶香茶菜0.5 g，共6份，分别加入约0.05 g对照品，测定吸光度计算加样回收率，平均回收率为100.40%，RSD为2.13%。

方法学试验结果表明，采用紫外分光光度法测定尾叶香茶菜总二萜含量，重现性好，简单方便，稳定可靠。

2.2 提取工艺研究

2.2.1 单因素试验

分别以乙醇浓度、超声提取时间、温度和功率为主要因素来进行单因素试验，乙醇浓度分别考察了50%，60%，70%，80%，90%，95%的乙醇、提取时间分别考察了10，20，30，40，50，60 min的超声提取时间、提取温度分别考察了30，40，50，60，70℃的超声提取温度、功率分别考察了300，360，420，480，540 W的超声提取功率，以上样品的提取液以3 000 r/min条件下离心10 min，取上清液按“1.2.2样品溶液的制备”测定吸光度，试验结果见图1。由图1可知，在乙醇浓度为60%时二萜类化合物的提取效率最高，故乙醇浓度控制在50%～70%为佳；二萜含量随着提取时间的增加而增加，考虑到试验效率，提取时间在20 min后，总二萜的含量相差不大，故提取时间选取20 min；提取温度在50℃时总二萜的提取效率最高，故温度条件控制在30～60℃为佳；随着提取功率的增加，提取效率不断地上升，其中在300～420 W之间提取效率增加幅度最大，考虑经济因素和成本因素，超声功率选择300～420 W为佳，研究结果表明最佳提取工艺为60%乙醇浓度、使用300～420 W的超声功率在50℃提取20 min。

图1 尾叶香茶菜总二萜提取单因素试验结果

2.2.2 响应面试验

依据Box-Behnken的设计原理[14]，再根据单因素试验结果，固定提取时间设定为20 min，如表1以乙醇浓度、提取温度、超声功率三因素作为自变量，总二萜提取含量比率为响应值，设计3因素3水平一共17个试验点的响应面试验。采用Design-Exipert软件对表1数据进行方差分析，结果见表2，使用二次多项式回归，拟合得到总二萜含量对3个因素功率(A)、温度(B)、乙醇浓度(C)的二次多项式方程为：

Y=-36.58+0.03A+0.27B+0.83C-1.52×10-4AB+6.20×10-4AC-3.94×10-4BC-8.05×10-5A2-1.33×10-3B2-8.24×10-3C2

表1 尾叶香茶菜总二萜提取响应面试验结果

由表2可知，P=0.011 8，说明该模型方程显著，失拟项的P=0.8927，意味着失拟项不显著；由表2可知，B(温度)是极显著性因素(P=0.0008)，C和C2是显著因素(P<0.05)，表明C(乙醇浓度)对提取二萜类化合物的影响不是简单的线性关系。超声功率对二萜类成分提取影响不显著(P>0.05)。由图2可知，二萜类化合物含量随温度的升高而增加，随着乙醇浓度的增加而增加，当温度为60℃和乙醇浓度为64.13%时，到达最大值。R2=0.890 5，说明了该模型能够解释89.05%响应值的变化。adjR2与 Pred R2值相差不大，表明该响应面方程不需要再做进一步的优化。

表2 响应面试验提取总二萜的含量方差分析结果

注：R2=0.890 8；adj R2=0.750 3；Pred R2=0.625 3；*P<0.05，**P<0.01

图2 提取温度和乙醇浓度对二萜类类物质提取率的响应面和等高线图

通过软件分析Y最大时，A=397.75，B=60.00，C=64.13，考虑可行性，结果修正为功率400 W，温度60℃，乙醇浓度64%。为了验证试验结果的可靠性，以最优条件进行3次验证试验，计算尾叶香茶菜总二萜含量，求得平均值为5.48%，而预测总二萜的含量为5.54%，实际值与预测值较为接近，验证了所建立的模型的正确性，也说明了响应面的分析方法适合于尾叶香茶菜中总二萜的超声辅助提取工艺的优化。

3 结论

本文研究了超声辅助提取尾叶香茶菜总二萜工艺的优化。含量测定中以Kamebakaurin作为对照品，采用紫外分光光度法来测定尾叶香茶菜中总二萜的含量，方法学试验结果表明，采用紫外分光光度法测定尾叶香茶菜总二萜含量，重现性好，简单方便，稳定可靠。

单因素试验分别以乙醇浓度、超声提取时间、温度和功率为主要因素来进行单因素试验，通过比较总二萜的提取率确定了最佳提取工艺的乙醇浓度、超声功率、提取温度和时间。在单因素试验结果的基础上，依据Box-Behnken的设计原理，使用响应面设计方法，以乙醇浓度、提取温度、超声功率三因素作为自变量，总二萜提取含量比率为响应值，设计3因素3水平一共17个试验点的响应面分析试验，并使用二次多项式回归建立响应面方程对提取工艺进行筛选和优化，最终确立其最佳的提取条件为：功率400 W，温度60℃，乙醇浓度64%。本法可节省时间和溶剂，生产成本也较低，建立一个提取二萜化合物的工艺流程，为开发利用此资源提供了另一条途径。

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