参萸补血方对再生障碍性贫血模型小鼠Th17细胞及其相关因子IL—6、IL—17及IL—23表达水平的影响

曾清 陆海颂 程纬民 何艾 邓德君 赖春凤

[摘要] 目的 觀察参萸补血方对再生障碍性贫血（AA）模型小鼠Th17细胞及其相关因子白细胞介素6（IL-6）、IL-17及IL-23表达水平的影响，探讨其治疗AA的效果。 方法 选取清洁级BALB/c小鼠80只，按随机数字表法分为正常对照组、模型组、参萸补血方组、强的松（阳性对照）组。以60CO-γ射线照射加腹腔注射环磷酰胺（CY）加氯霉素（CH）复合方法建立AA小鼠模型。造模成功后给药干预，连续4周后观察各组小鼠外周血象改变及各组小鼠Th17细胞及其相关因子IL-6、IL-17及IL-23表达水平的变化，光镜下观察骨髓增生程度。 结果 与正常对照组比较，模型组小鼠外周血象和骨髓增生明显降低，Th17细胞及其相关因子IL-6、IL-23和IL-17表达均显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型组比较，参萸补血方组小鼠外周血像明显升高，Th17细胞及其相关因子IL-6、IL-23和IL-17表达水平下降，骨髓增生明显改善，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 参萸补血方可改善AA模型小鼠的骨髓造血功能，可能与其抑制T细胞免疫功能相关的IL-6、IL-17及IL-23表达水平有关。

[关键词] 再生障碍性贫血；参萸补血方；Th17细胞；白介素17；白介素6

[中图分类号] R556.53 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）04（c）-0013-04

Effects of Shenyu Buxue Decotion on the Th17 cells and expression of its related IL-6， IL-17 and IL-23 expression in mice with aplastic anemia

ZENG Qing1 LU Haisong1 CHENG Weimin1 HE Ai1 DENG Dejun2 LAI Chunfeng3

1.Department of Hematology， the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530023， China； 2.Graduate School， Guangxi University of Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 500001， China； 3.Department of Oncology， Yullin Traditional Chinese Medicine Hospital， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Yulin 537000， China

[Abstract] Objective To observe the effect of Shenyu Buxue Decotion on Th17 cells and the expression of IL-6， IL-17 and IL-23 in aplastic anemia （AA） model mice， and to explore its curative effect for AA. Methods Eighty clean-class BALB/c mice were divided into control group， model group， Shenyu Buxue Decotion group and Prednisone （positive control） group by random number table. The AA models were established by irradiated with 60CO-γ ray together with intraperitoneal injection of cyclophosphamide （CY） and chloramphenicol （CH）. After AA models were successfully established， mice were given to medicines for 4 weeks. The changes of mice peripheral hemogram， Th17 cells and the expression levels of IL-6， IL-17 and IL-23， and the degree of bone marrow hyperplasia under light microscope were observed. Results Compared with the control group， the peripheral hemogram and bone marrow hyperplasia were decreased， while Th17 cells and expression of IL-6， IL-23 and IL-17 were increased in the model group， with statistically significant difference （P < 0.05）. Compared with the model group， in the Shenyu Buxue Decotion group， the peripheral hemogram were increased， Th17 cells and the expression of IL-6， IL-23 and IL-17 were decreased， and bone marrow hyperplasia was improved， with statistically significant difference （P < 0.05）. Conclusion Shenyu Buxue Decotion can improve the bone marrow hematopoietic function of AA mice， which may due to the inhibition of the T cell immune function related IL-6， IL-17 and IL-23.

[Key words] Aplastic anemia； Shenyu Buxue Decotion； Th17 cell； IL-17； IL-6

参萸补血方由党参、山萸肉、茯苓、仙灵脾、白术、杜仲等组成，具有温补脾肾的功效，临床用于再生障碍性贫血（AA）治疗，效果显著，观察发现免疫调节是其主要疗效机制之一。本研究通过观察参萸补血方对AA小鼠骨髓增殖及T细胞免疫功能及其相关的白细胞介素6（IL-6）、IL-17及IL-23表达水平的影响，探讨其治疗AA的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 BALB/c小鼠80只，雄性，SPF级，体重18～22 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。实验动物许可证编号：SCXK（湘）2013-0004。

1.1.2 主要药品及试剂 环磷酰胺（Cyclophosphamide，CY），江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：16092225。氯霉素（Chloramphenicol，CH），陕西省西安妇幼制药厂，批号：912525。醋酸泼尼松片，天津力生制药股份有限公司，批号：1607021。IL-6试剂盒，cusalio，编号：CSB-E04639m。IL-23试剂盒，cusalio，编号：CSB-E08463m。IL-17试剂盒，欣博盛生物科技有限公司，编号：EMC008CH。中药材由广西中医药大学第一附属医院（以下简称“我院”）药剂科提供。

1.1.3 仪器 美国VARIAN电子直线加速器，迈瑞BC-1800plus全自动血液分析仪，德国EPPENDORF 5418产离心机，美国Thermo酶标仪，Olympus BEION V4.2型显微镜等。

1.2 实验方法

1.2.1 AA小鼠模型的建立 AA小鼠模型建立：第1天BalB/C小鼠1次全身3 Gy 60CO-γ射线均匀照射，能量8 Me-V，单次剂量300 cGy，源皮距100 cm，照射时间1 min[1-2]。照射后第4～6天各行1次腹腔注射（ip）CY 50 mg/kg及CH 62.5 mg/kg[2-3]。自由饮水。至第2周末，形成AA模型。

1.2.2 动物分组与给药 80只清洁级雄性BalB/C小鼠按随机数字表法分为正常对照组、参萸补血方组、强的松（阳性对照）组、模型组4组。正常对照组不造模，普通饲料喂养，自由饮用蒸馏水；根据实验方法学，人鼠折算公式计算，参萸补血方组小鼠以30 mg/（kg·d）的药物浓度灌胃；阳性对照组以药物浓度为9.1 mg/（kg·d）的泼尼松片灌胃；模型组以10 mL/（kg·d）生理盐水灌胃，至第4周末实验结束。

1.3 观察指标

1.3.1 动物一般情况 在实验过程中，每天观察并记录各组小鼠的饮食、活动、毛色、体重和死亡情况。

1.3.2 标本处理 实验结束，处死各组小鼠。各组小鼠通过摘取眼球、眼眶取血备用，随后颈椎脱臼处死，分离出双侧股骨。剪截取右侧股骨中段7 mm处，用空气快速吹打出骨髓液，制成骨髓涂片，瑞氏-吉姆萨染色，送我院检验科观察骨髓象。

1.3.3 检测方法 光镜下评估骨髓增生程度及骨髓非造血细胞（包括淋巴细胞、单核细胞、浆细胞等）百分率变化。瑞氏染色骨髓增生程度判断标准如下：增生极度减低（-），红细胞与有核细胞之比为100～300∶1；增生减低（+），红细胞与有核细胞之比为35～70∶1；增生活跃（++），红细胞与有核细胞之比为16～32∶1；增生明显活跃（+++），红细胞与有核细胞之比为5～12∶1；增生极度活跃（++++），红细胞与有核细胞之比为0.5～2.0∶1。

外周血象送我院检验科进行外周血象计数；采用流式细胞仪检测PBMCs的Th-17/CD4+细胞比例；用ELISA检测血清IL-6、IL-23、IL-17的水平，按试剂盒操作说明书进行。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；等级资料采用Kruskal-Wallis检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

正常组小鼠一般情况良好，毛被光泽，行动灵活，食量及大便正常。模型组小鼠形体消瘦，精神不振，行动迟缓，行走不稳，食量明显减少，毛色无光泽易脱落；经治疗后，参萸补血方组和强的松组小鼠活动正常，一般情况较模型组明显好转。

2.2 外周血象

与正常对照组比较，模型组小鼠外周血中白细胞（WBC）、血红蛋白（HGB）和血小板（PLT）数量减少，差异均有统计学意义（P < 0.05）。与模型组比较，参萸补血方组与强的松组小鼠外周血中WBC、HGB和PLT数量增加，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.3 骨髓细胞学检测

2.3.1 外观取材涂片观察 肉眼观察：正常对照组小鼠骨髓涂片涂膜面厚薄适中，无脂肪珠，可见骨髓小粒；模型组小鼠骨髓涂片涂膜面较薄，可见脂肪珠，无明显骨髓小粒。参萸补血方组和强的松组之间骨髓涂片肉眼观察差别不明显，涂膜面厚薄适中，无脂肪珠，骨髓小粒介于模型组与正常对照组之间。

2.3.2 骨髓细胞形态学分析 镜下观察：正常对照组小鼠骨髓全片小粒明显，无油滴，骨髓增生活跃，有核细胞密布，各系比例大致正常，成熟红细胞形态正常，巨核细胞多见，血小板多见，成簇分布。模型组小鼠部分骨髓涂片出现油滴，骨髓全面衰竭呈增生障碍，造血细胞减少，非造血细胞增多，成熟红细胞大小一致，无明显淡染区，巨核细胞缺如，血小板减少。参萸补血方組与强的松组小鼠骨髓衰竭程度明显减轻，油滴较模型组明显减少，仅见少量脂肪空泡，部分骨髓片可见散在造血灶，偶见巨核细胞，血小板散在。见图1。