离体灌注新型去垢剂用于组织工程人工肺构建实验

马金辉，于 洁，乔叶薷，侯陈玮，陈书弘，黑飞龙

急性、慢性肺损伤均可能导致终末期肺病。对终末期肺病患者来说,肺移植是唯一有效的治疗方式。然而,由于供体缺乏,仅有不到20%的患者有机会进行肺移植手术,而且需要长期服用免疫抑制剂,10年的死亡率超过60%［1］。组织工程人工肺基于脱细胞肺支架,种植宿主自体细胞,在未来有望提供一种理想的供体来源［2］。灌注去垢剂法制备脱细胞肺支架,已经被证明可以有效的去除肺内细胞,同时最大程度的保留细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白［3］。灌注途径主要有经主肺动脉和经主支气管两种［4］,目前,经支气管途径受到越来越多的关注。本研究经支气管途径灌注一种新型去垢剂制备脱细胞支架,有望提供一种简便、有效的脱细胞方法。同时制备一种简易的生物反应器来种植种子细胞,为细胞的有效种植奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 动物与设备 清洁级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠18只,200～220 g,购于阜外医院实验动物中心,实验通过医院动物伦理会批准。Langendorff灌流系统(北京众实迪创科技发展有限责任公司),蠕动泵(kamoer),组织匀浆仪(Roche),冷冻干燥机(Labconco),光学显微镜及激光扫描共聚焦显微镜(Leica),全自动细胞计数仪(赛默飞),HL-2恒流泵(上海沪西分析仪器厂)。

1.2 主要试剂 十二烷基醚硫酸钠(sodium lauryl ether sulfate,SLES)(河北万冶化工股份有限公司),肺泡II型上皮细胞(A549细胞,ATCC),6-二脒基-2-苯基吲哚(4＇,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)及F12K培养基(Sigma),DNA提取试剂盒(Qiagen),DAPI封片剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 取材与分组 18只SD大鼠,腹腔内注射3%戊巴比妥钠溶液(150 mg/kg),麻醉满意后快速打开胸腔,心、肺、支气管整体切除。随机分为3组(n＝6):正常肺组,不经任何处理；脱细胞肺支架组(n＝6):灌注去垢剂,制备脱细胞肺支架；种植细胞肺组(n＝6):脱细胞肺支架种植A549细胞,在生物反应器中培养3 d。

1.3.2 脱细胞肺支架的制备 经主支气管插入16 G灌注头,心肺团悬吊至langendorff操作台。保持灌流压力为20 cmH2O,25℃。分别灌注:①肝素化(10 U/ml)的去离子水15 min。②去垢剂:0.1%SLES溶液2 h,去离子水清洗15 min。③1%Triton X-100 10 min,去离子水清洗15 min。④1 mol/L的氯化钠溶液1 h,去离子水清洗15 min。⑤含抗生素(青霉素G 500 U/ml,链霉素500 μg/ml)的 PBS清洗2 h。将制备的脱细胞肺支架置入磷酸盐平衡盐水(phosphate buffer saline,PBS)中,4℃ 保存备用。

1.3.3 脱细胞效果评价 HE染色:正常肺和脱细胞支架组织,4%的多聚甲醛固定48 h,常规脱水、包埋、切片5 μm,按常规行HE染色。光镜下拍照。

DAPI染色:正常肺和脱细胞肺支架组织的石蜡切片,68℃,45 min,常规脱蜡至水；含DAPI的封片剂直接滴加在标本上,5 min后封片,共聚焦显微镜下拍照。

DNA定量检测:正常肺组织和脱细胞支架组织,经冷冻干燥机干燥,各称取25 mg,剪碎,匀浆,蛋白酶K 20 μl消化过夜。按照DNA试剂盒说明书提取DNA。在分光光度计260 nm下读取数值,计算出DNA浓度,单位为ng/mg。

1.3.4 简易生物反应器的制作及细胞种植 自制的简易生物反应器主要由蠕动泵、主容器和循环管路组成。通过主支气管循环灌注培养基,能够保证均匀地不停地传输细胞营养物质。脱细胞肺支架在细胞种植前用无菌PBS液冲洗30 min。A549作为种子细胞,培养、提取、计数,将40×106个细胞稀释到10 ml的F12K完全培养基(加10%胎牛血清,1%青霉素/链霉素,2 mmol L-谷氨酰胺,1 mmol非必需氨基酸),用注射器把细胞经主支气管注入到支架内。支架在培养基中静置2 h。支架连接生物反应器,在37℃、95%O2、5%CO2的细胞培养箱中培养,培养基的容量约100～150 ml,循环速度设定为5 ml/min,每24 h更换1半培养基［5］。整个过程在无菌操作平台进行。

1.3.5 种植效果的评价 在细胞种植3 d后,PBS冲洗肺支架,常规行HE染色、DAPI染色、DNA定量检测。

1.4 统计方法 采用SPSS 19.0进行统计分析,DNA数据结果以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,P＜0.05为有显著性差异,作图采用GraphPad Prism 6软件。

2 结 果

2.1 脱细胞过程大体观察 正常肺灌注0.1%SLES溶液2 h后接近半透明(图1C),全部灌注完成后,制备的脱细胞肺支架更加透明,肺内肺泡结构清晰可见(图1D)。整个脱细胞过程,肺的形态结构变化轻微。

图1 脱细胞肺支架的制备

2.2 简易生物反应器 主容器采用250 ml蓝口瓶,循环管路采用一次性输液器,蓝口瓶的瓶口设有通风孔,整个循环过程可以维持一个相对无菌、封闭的环境。见图2。

图2 自制生物反应器

2.3 HE染色、DAPI染色观察 正常肺内布满细胞(图3A,D),经过脱细胞后,可以看到脱细胞肺支架内完全无残留的细胞(图3B),甚至无任何细胞核和细胞碎片(图3E)。经过种植A549细胞后,可见A549细胞在脱细胞肺内均匀生长、浸润(图3C,F)。

2.4 DNA含量 DNA结果分析显示,与正常肺相比,脱细胞肺支架内的DNA含量显著下降(n＝6,P＜0.01)；与脱细胞肺支架相比,种植A549细胞后的肺内DNA含量明显上升(n＝6,P＜0.01),但仍未达到正常肺的水平,有显著性差异(n＝6,P＜0.01)。正常肺组(1 030.20±30.27)ng/mg,脱细胞肺支架组(38.42±2.45)ng/mg,种植细胞肺组(662.27±7.58)ng/mg,见图 4。

图3 HE染色(比例尺100 μm)和DAPI染色(比例尺75 μm)

图4 DNA定量分析结果(n＝6)

3 讨 论

构建组织工程人工肺首先通过脱细胞获得无细胞的肺支架,其次为了避免排斥反应,利用宿主的骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、诱导多潜能干细胞等诱导分化为各种肺内细胞,最后在可以维持肺的循环灌注和通气功能,模拟肺内环境的生物反应器内进行培养,形成一个具有气体交换功能的人工肺［6］,旨在为肺移植患者提供一种器官来源,具有很大的临床研究价值。

制备组织工程人工肺的第一步是获得脱细胞肺支架,保留完整的生化成分、微循环结构、三维结构［7］。但是用于脱细胞的传统的去垢剂如脱氧胆酸钠(SDC)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)和3-［3-(胆酰胺丙基)二甲氨基］丙磺酸内盐都作用较强［8-10］,ECM 蛋白破坏严重［11］,使脱细胞肺支架丧失了一定的结构和功能,影响细胞化和血管化；同时,呼吸膜破坏严重,气体交换能力难以维持。

SLES是一种新型去垢剂,和SDS均属于阴离子去垢剂,头部带亲水性负电荷,可以溶解细胞质、细胞核、细胞膜。但是SLES含有乙氧基(C2H5O-),使得化学特性比SDS温和。此外,SLES具有优良的去污能力、生物降解性和低温性能。2015年,Kawasaki首次报道了SLES用于心脏的脱细胞,显示出很好的脱细胞效果［12］。本课题组前期对比了经主肺动脉灌注SDS与SLES进行肺的脱细胞,结果显示SLES不仅能有效地去除肺内细胞,ECM蛋白保留的更加完整,皮下移植实验显示SLES肺支架具有更好的组织相容性和血管形成能力,对于肺脏这种结构疏松的器官可能使用SLES更加适合［13］。

langendorff系统已经被证明可以有效地用于脱细胞肺支架的制备［14-15］。本研究中,笔者利用langendorff系统经主支气管对SD大鼠肺离体灌注SLES,取得了良好的脱细胞效果,HE染色、DAPI染色显示无残留的细胞及细胞核,DNA含量小于50 ng/mg,DNA去除率达到96.27%,完全达到了组织工程学要求［16］。有研究表明,与经主肺动脉灌注相比,经主气管灌注制备的脱细胞肺支架在机械性能上也没有统计学差异［17］,但是后者操作更加简捷、DNA含量更低、毛细血管网络保留的更加完整［18］,这对于维持气血屏障的完整性和促进生物人工肺的再细胞化和功能化至关重要［19］。

生物反应器通过模拟肺脏的生理状态,使种子细胞更加有效地到达肺远端区域,实现脱细胞肺支架的细胞化,体内移植后可以避免裸支架形成血栓和呼吸膜纤维化,从而使气体交换更加有效。笔者参考文献［20］设计的这款简易生物反应器,通过循环灌注培养基,实现种子细胞的黏附、增殖和迁移。可以看到A549细胞可以在脱细胞肺支架内均匀、快速的生长、浸润,培养3 d后DNA含量就达到了正常肺的64.67%。

本研究中使用的生物反应器未能提供机械通气,与维持肺的生理状态内环境尚有一定差距。有研究表明,维持通气功能可以避免肺部萎缩,有助于维持肺的顺应性、抵抗力、弹力等,保证营养物质灌注到肺内毛细血管网络,但是体外模拟肺实现通气功能还存在巨大的挑战［21］。虽然没有提供通气功能,但是通过循环灌注培养基可以实现人工肺的初步基本构建。最近有学者对可进行气体交换的生物反应器进行探索,取得了一定的进展［22-23］。

本研究报道了经支气管途径灌注SLES制备脱细胞肺支架的具体方法,并通过生物反应器验证了种子细胞在这种脱细胞肺支架上的种植效果。相信,随着组织工程学和再生医学的不断发展,组织工程人工肺一定能不断完善,最终应用于临床。

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