水产品中甲基睾酮残留物检测方法对比研究

黄鸾玉，韦信贤，童桂香，杨姝丽，吴祥庆，蒙源，吴明媛

（广西水产科学研究院，广西 南宁530021）

甲基睾酮（methyltestosterone，MET）是一种人工合成的类固醇类雄性激素，又称甲基睾丸素和甲睾酮。由于MET药效显著且稳定，容易获得，在渔业生产中已有50年使用史，育苗期间的使用尤为普遍。MET具有增强雄性体征和蛋白质同化的双重作用，能提高饲料转化率并促进动物生长[1]，育苗期间常通过药饵投喂、浸浴幼鱼等给药方式来促进苗种性别转变，提高个体增长速率，最终大幅度提高水产养殖经济效益。MET在动物体内代谢缓慢，蓄积性强，通过食物链进入人体会产生严重的副作用，比如扰乱激素平衡、影响生育能力，致胎体中毒、致肝中毒和致癌等[2-4]，导致国人对水产品质量安全的信心下降，出口贸易频遭绿色壁垒。因此，检测水产品中MET残留量尤为迫切。

目前水产品中MET的检测方法有高效液相色谱法[5-8]、高效液相色谱-串联质谱法[9-10]、气相色谱-质谱法[11]、酶联免疫法[12]、化学发光法[13]、毛细管电泳法[14]等。酶联免疫法的缺点是易出现假阳性，只能用作初步筛查。液相色谱-质谱法仪器昂贵，不利于在各级检测机构全面开展检测工作。气相色谱-质谱法需要对分析物进行衍生化，结果不稳定。相对而言，高效液相色谱法更能满足日常检测需求。中国水产行业标准正是采用液液萃取-高效液相色谱法测定水产品MET残留物[8]。在日常检测工作中，发现该方法净化效果不好，仪器分析时间长，加标回收率偏低，不适合批量检测，很有必要进行优化。本研究以中国水产行业标准SC/T3029-2006《水产品中甲基睾酮残留量的测定》为基础，对液相色谱法测定水产品中MET含量的两种前处理方法及色谱条件的线性、精密度、回收率、稳定性、适用性等方面进行对比试验，目的是寻找最合适检测水产品中MET残留量的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

超高压液相色谱仪（ACQUITY UPLC）：美国Waters公司；高效液相色谱仪（Agilent1200）、固相萃取装置：德国 Agilent公司；平行蒸发仪（Syncore Polyvap）：瑞士buchi公司；循环水冷却器（H35）：莱伯泰科有限公司；多管架自动平衡离心（TDZ5-WS）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；往复式振荡器（ZWF-334）：上海智城分析仪器制造有限公司；离心机（TD6M）：长沙平凡仪器仪表有限公司；固相萃取柱（poly-sery HLB，60 mg，3 mL）：上海安谱实验科技股份有限公司。

1.1.2 试剂

MET标准物质（纯度98%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈（色谱纯）：美国Tedia公司；无水乙醚（分析纯）：西陇化工有限公司；石油醚（色谱纯）：国药集团化学有限公司；甲酸、异丙醇（色谱纯）：天津市光复精细化工研究所；酸化乙腈：乙腈-甲酸（199/1，体积比）。

检测样品按照《水产品抽样方法》[15]的规定处理。

1.2 MET检测方法

1.2.1 标准溶液配制

准确称取MET标准物质10.2 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，配成100 μg/mL的标准溶液，-18℃存放。使用前用甲醇稀释成5 μg/mL工作液，再分别移取适量工作液，用80%甲醇水溶液配成浓度分别为0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000、2.500 μg/mL 的标准工作曲线。

1.2.2 样品制备

将供试样品置于常温条件自然解冻，取适量样品制成细小、均匀的鱼糜样。

1.2.3 样品提取与净化

方法1：参照中国水产行业标准SC/T3029-2006《水产品中甲基睾酮残留量的测定》，稍有改进。具体方法：称取（5.00±0.05）g样品置于 50 mL离心管中，加入15 mL无水乙醚，振荡提取10 min，4 000 r/min离心5 min，将上清液转移至平行蒸发管中，再向离心管中加入10 mL无水乙醚，重复提取1次，上清液合并至蒸发管中，经40℃平行蒸发至干。用3 mL 80%的甲醇水溶液溶解残渣，加入3 mL石油醚，旋涡混匀去脂，转入10 mL离心管中，6 000 r/min离心10 min。弃去石油醚层，取下层溶液过0.22 μm微孔滤膜，供高效液相色谱仪测定。

方法 2：称取（5.00±0.05）g样品置于 50 mL离心管中，加入15mL酸化乙腈，匀浆30s，振荡提取10min，4 000 r/min离心5 min，将上清液转移至平行蒸发管中，再向离心管中加入8 mL酸化乙腈，重复提取1次，上清液合并至蒸发管中。向蒸发管中加入10 mL异丙醇，经55℃平行蒸发至干。用3 mL甲醇溶解残渣，加入7 mL纯净水，混匀，转入15 mL离心管中，放置冰箱冷冻30 min，6 000 r/min离心10 min。取甲醇溶液层通过预先用3 mL甲醇、3 mL水活化的HLB柱上样，以小于2 mL/min的流速过柱，弃去滤液，用6 mL水淋洗，待淋洗液全部流出后抽HLB柱近干，弃去流出液，用4 mL 80%的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，定容至4 mL，混匀，过0.22 μm微孔滤膜，供超高压液相色谱仪测定。

1.2.4 色谱条件

1.2.4.1 高效液相色谱法

色谱柱：Luna 5u C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（78/22，体积比）；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；检测波长：254 nm。

1.2.4.2 超高压液相色谱法

色谱柱：BEH C18 柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：甲醇-水（70/30，体积比）；流速：0.2 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL；检测波长：254 nm。

1.2.5 计算公式

以保留时间定性，峰面积定量，根据下式计算水产品MET的残留量。

式中：C 为样品中 MET 的含量，（μg/kg）；c为由标准曲线查得提取液中MET的含量，（μg/mL）；v为提取液定容体积，mL；n为稀释倍数；m为称样量，kg。

2 结果与讨论

2.1 数据的采集

2.1.1 高效液相色谱法

在高效液相色谱法的仪器条件下，用进样器进20 μL浓度为1 μg/mL的标准溶液，再分别进20 μL经过方法1前处理后的空白样品和加标浓度为100 μg/kg的加标样品，根据其出峰时间定性，考察MET信号响应强度、溶剂杂质响应强度和样品分离效果。结果见图1。

由图1可知，MET出峰时间为7.1 min～7.5 min。用无水乙醚作为提取剂，溶剂峰明显高于目标峰。样品图谱复杂，目标峰附近杂峰多，容易干扰目标峰定性与定量分析。有研究表明，用石油醚、正己烷除脂时，两种试剂均会对目标峰组分造成一定干扰[16]。因此，需要对方法1的提取剂及除脂方式进行优化。

图1 高效液相色谱法图谱Fig.1 Chromatograms of high performance liquid chromatography

2.1.2 超高压液相色谱法

MET结构式中有极性的羟基、羧基和非极性的碳环[17]，易溶于乙腈，同时因为存在羟基，采用酸性条件更利于提取，因此，方法2选择酸化乙腈来沉淀部分样品蛋白质，提取MET。在超高压液相色谱法的仪器条件下，用进样器分别进5 μL浓度为0.1 μg/mL的MET标准溶液、经方法2前处理的空白样品和100 μg/kg加标样品提取液，色谱图见图2。

图2显示，MET出峰时间为3.8 min～4.2 min。用酸化乙腈作为提取剂，溶剂峰明显降低。样品经冷冻离心脱脂，再经HLB柱净化，目标峰附近没有杂峰，定性和定量分析均不受杂峰干扰。

图2 超高压液相色谱法图谱Fig.2 Chromatograms of ultra-high pressure liquid chromatography

2.2 线性关系

将1.2.1所配的标准溶液分别用1.2.4的两种色谱条件进行检测，以峰面积对浓度做标准曲线，进行线性回归分析。高效液相色谱法的标准曲线为Y=11.5723X-0.132 3，r=0.999 1，在 0.050 μg/mL～1.000 μg/mL 范围内线性关系良好；超高压液相色谱法的标准曲线为Y=70163.9X-117.2，r=0.9996，在 0.025 μg/mL～2.500 μg/mL范围内线性关系良好。相关系数表明，超高压液相色谱法有相对较宽的线性范围。

2.3 检出限

本试验以3倍信噪比（S/N）对应的浓度计算方法检出限，得到方法1的检出限为10 μg/kg，方法2的检出限为5 μg/kg。方法2降低了溶剂峰和基质干扰，检出限明显降低。

2.4 精密度试验

取同一浓度的MET标准品，分别用两种色谱条件平行测定5次，分别计算MET含量，考察精密度，结果列于表1。

表1 精密度试验结果（n=5）Table 1 The precision experimental results（n=5）

两种检测方法的RSD均小于10%，均能满足检测需求。

2.5 加标回收率试验

为考察两种方法的准确度，以未检出MET的罗非鱼肌肉作为空白样品，设计10、50、100 μg/kg的加标浓度，测定MET的回收率，每种方法每个加标浓度平行测定5次，结果见表2。

表2 不同方法MET回收率（n=5）Table 2 Rate of recovery in different methods（n=5）

由表2可知，方法1的回收率在70.0%～80.4%之间，测定值的相对标准偏差在4.2%～9.1%之间；方法2的回收率在81.2%～91.1%之间，测定值的相对标准偏差在2.3%～5.5%之间。在相同加标浓度下，方法2的平均回收率和精密度高于方法1。方法2的3个加标浓度的平均回收率均大于80%；方法1在其10倍检出限浓度水平（100 μg/kg）下，才获得80.4%的平均回收率，回收率偏低。

2.6 样品检测对比

取50个不同的水产品样品，按照1.2.3的处理过程，同时采取两种方法检测，方法2前处理因要使用HLB柱净化，需要0.7 h，冷冻脱脂需要0.5 h，比方法1前处理的时间长。方法2检测出峰时间为4 min左右，仪器测试一个样品需要7 min，而方法1仪器测试一个样品需要15 min。仪器测试50个样品方法2比方法1节约了约6.7 h。从整体检测时间来分析，方法2更快捷。从检测准确性来比较，方法2结果更稳定准确。

3 结论

通过对比研究，两种方法线性相关系数均大于0.999 0，线性关系均良好，方法2检测信号干扰较少，检出限达到5 μg/kg，比方法1低1倍。方法2的回收率和精密度比方法1高，结果相对准确。方法2仪器分析流速为0.2 mL/min，比方法1节约流动相0.8 mL/min；方法2仪器分析时间较短，每进一个样可以节约8 min。大批量进样的时候，方法2可以节约数量可观的流动相和分析时间，实用性强，更适合快速测定水产品中MET残留物的含量。

参考文献：

[1]彭家杰,李绪鹏,胡浩光,等.高效液相色谱法测定水产品中甲基睾酮残留量前处理方法的改进[J].中国渔业质量与标准,2014,4(2)：56-60

[2]VICK A M,HAYTON W L.Methyltestosterone pharmacolinetics and oral bioavailability in rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)[J].Aquatic Toxicology,2011,52(3/4)：177-188

[3]李佩佩,郭远明,陈雪昌,等.凝胶渗透色谱-固相萃取/高效液相色谱法同时测定水产品中甲基睾酮与己烯雌酚[J].分析测试学报,2013,32(2)：267-270

[4]李俊锁,邱月明,王超.兽药残留分析[M].上海：上海科学技术出版社,2002：256-299

[5]陈培基,李刘冬,邹琴,等.高效液相色谱法测定水产品中甲基睾丸酮残留量的优化研究[J].食品科学,2010,31(6)：223-226

[6]MARWAH A,MARWAH P,LARDY H.Development and validation of a high performance liquid chroma tograph assay for 17α-methyltestosterone in fish feed[J].J Chromatogr B,2005,824(1)：107-115

[7]JIANG Jie,LIN Hong,FU Xiaoting,et al.Preliminary validation of high performance liquid chroma tography method for detection of methyltestosterone residue in carp muscle[J].Journal of OceanUniversity of China,2005,4(3)：248-251

[8]全国水产标准化技术委员会.水产品中甲基睾酮残留量的测定：液相色谱法：SC/T 3029-2006[S].青岛：中国海洋大学,2006：2-3

[9]聂建荣,朱孟丽,朱铭立,等.HPLC-MS/MS快速检测水产品中甲基睾丸酮的研究[J].广东农业科学,2008(6)：107-109

[10]CHU P S,LOPEZ M,SERFLING S,et al.Determination of 17αmethyltestosterone in muscle tissues of tilapia,rainbow trout,and salmon using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Agric Food Chem,2006,54(9)：3193-3198

[11]Samuels T P,Nedderman A,Seymour M A,et al.Study of the metabolism of testosterone,nandrolone and estradiol in cattle[J].Analyst,1998,123(12)：2401-2914

[12]LU H H,CONNEELY G,CROWE M A,et a1.Screening for testosterone,methyltestosterone,19-nortestoterone residues and their metabolites in bovinewith enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)[J].Anal Chim Acta,2006,570(1)：116-123

[13]曾丹云,吉邢虎,何治柯.甲基睾酮-KMnO4-Ru(bipy)32+-Ce(Ⅳ)化学发光检测甲基睾酮的研究[J].分析科学学报,2005,21(5)：504-506

[14]黄晓东,林子俺,谢增鸿.甲基睾酮的毛细管电泳法测定[J].闽江学院学报(自然科学版),2006,27(2)：91-94

[15]中华人民共和国农业部.水产品抽样方法：SC/T 3016-2004[S].青岛：国家水产品质量监督检验中心,2004：6-7

[16]罗玲,刘伶俐,洪波,等.HLB柱净化-高效液相色谱法分析水产品中甲基睾酮残留物[J].分析试验室,2014,33(7)：844-846

[17]李佩佩,梅光明,张小军,等.固相萃取-高效液相色谱法测定水产品中的甲基睾酮残留量[J].食品科学,2012,33(22)：282-285