影响双酶复配同步酶解制备核桃多肽的因素

王纪辉，田娅玲，侯娜，*，耿阳阳，胡伯凯，梁美，何佳丽

（1.贵州省林业科学研究院贵州省核桃研究所，贵州贵阳550005；2.黔东南民族职业技术学院，贵州黔东南苗族侗族自治州556000）

核桃（Juglans regia），又称胡桃、羌桃，为胡桃科植物。核桃富含脂肪、蛋白质等营养成分，即可生食，又可作为食品辅料进行添加[1]，目前核桃已经成为高效优质补品之一。核桃蛋白为优质蛋白质，每100 g核桃含有蛋白质16.67 g[2]，核桃蛋白中氨基酸种类齐全，含有8种必需氨基酸[1]，氨基酸中以精氨酸、谷氨酸含量最高[3-4]，在开发植物蛋白方面具有很大的市场前景。有关研究表明：冷榨后的核桃饼粕中蛋白质含量高达33.2%[5]，而目前我国的核桃饼粕大都用于饲养牲畜[6]，对核桃饼粕中富含的蛋白质资源造成极其不合理的利用与浪费[7]。有关科学研究发现，核桃多肽的生理活性较高，具有抑制炎症，清除体内自由基，延缓衰老等功能[8-9]，大力开发集天然、安全、高效于一身的核桃多肽抗氧化剂具有很广阔的市场潜力[10-11]。然而，目前对于水解核桃饼粕制备核桃多肽的研究大都集中于单一酶类，针对复合酶水解制备核桃多肽的研究则较少[12-14]，如果以不同酶类进行复合，充分利用其协同增效作用，对于提高核桃饼粕的水解程度具有重要的意义[15]。

因此，本研究以冷榨后的核桃饼粕为原料，水解度为考察指标，以双酶复配同步水解核桃饼粕为基础[16]，通过单因素和正交试验对双酶复配酶解核桃饼粕制备核桃多肽进行优化，研究结果对充分利用核桃副产物，提高核桃附加产值，助力贵州省实现脱贫攻坚具有重要的现实意义[17]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃冷榨饼粕：（实验室自制）；正己烷（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；木瓜蛋白酶（72×104U/g）、中性蛋白酶（14×104U/g）、碱性蛋白酶（9.3×104U/g）、胰蛋白酶（11×104U/g）、邻二氮菲、氢氧化钠（分析纯）：四川化工有限公司；DPPH（分析纯）：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

50T型液压榨油机：河南贝斯德粮油机械工程公司；101-1型电热鼓风干燥箱：鹤壁市天冠仪器仪表有限公司；L5S型紫外可见分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司；FD1A-50型冷冻干燥机：江阴市新申宝科技有限公司；FW-100型高速万能粉碎机：北京成萌伟业科技有限公司；TDL-40B型离心机：常州市仪都仪器有限公司；DEITA320型酸度计：上海平轩科学仪器有限公司；85-2A型恒温磁力搅拌器：常州金坛良友仪器有限公司；HH-54型恒温水浴锅：上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 核桃多肽制备

1.3.2 蛋白质水解度的测定

总氮的测定采用凯氏定氮法GB 5009.5-2016《食品安全国家标食品中蛋白质的测定》，氨态氮的测定采用双指示剂甲醛滴定法[18]。核桃饼粕中蛋白质水解度计算公式如下：

1.3.3 单因素试验

选择木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶作为水解酶类，在复合酶质量配比为（1∶1、1∶2、1∶3、2 ∶1、3 ∶1）、底物质量浓度为（10、20、30、40、50g/L），酶添加量为（1%、3%、5%、7%、9%），温度为（30、35、40、45、50、55、60 ℃），pH 值为（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0），酶解时间为（2、3、4、5、6 h），测定核桃饼粕中蛋白质的水解度，考察酶种类、复合酶配比、底物质量浓度、酶添加量、温度、pH值、时间对核桃饼粕中蛋白质水解效果的影响。

1.3.4 正交试验

在单因素研究的基础上，依据单因素研究结果，选择温度、pH值、底物质量浓度、时间、酶添加量为研究因素，以水解度为指标，研究影响双酶复合水解核桃饼粕制备核桃肽的因素。正交试验设计见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5 统计分析

研究数据（3次数据平均值±标准偏差）采用Excel2007制图及SPSS19.0进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶种类的选择

按复合酶质量配比为1∶2（中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶2）、温度35℃、pH 值 6.0、底物质量浓度 30 g/L、时间3 h、酶添加量3%，研究酶种类对水解度的影响，结果见图1。

由图1可以看出，4种蛋白酶均可以酶解核桃饼粕制备核桃多肽，然而4种酶的水解能力却有所不同，4种酶的水解能力大小顺序为中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞碱性蛋白酶＞胰蛋白酶，其中中性蛋白酶与木瓜蛋白酶之间差异性显著（p＜0.05），并且这2种酶与碱性和胰蛋白酶之间均呈现显著性差异（p＜0.05），但碱性蛋白酶与胰蛋白酶之间无显著性差异。4种蛋白酶均在其最适条件水解相同时间后，中性蛋白酶水解度最高（8.47%），效果最佳，胰蛋白酶水解程度最差（5.94%）。因此，后续研究选择中性蛋白酶和木瓜蛋白酶作为水解酶类。

图1 酶种类对水解度的影响Fig.1 Effect of enzyme species on degree of hydrolysis

2.1.2 复合酶质量配比对水解度的影响

以中性蛋白酶和木瓜蛋白酶为水解酶，按温度35℃、pH值6.0、底物质量浓度30 g/L、时间3 h、酶添加量3%，研究复合酶质量配比对水解度的影响，结果见图2。

图2 复合酶质量配比对水解度的影响Fig.2 Effect of compound enzyme mass ratio on degree of hydrolysis

由图2可知，复合酶质量配比为2∶1时（中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶），核桃蛋白水解程度最大，并且与其它复合酶质量比均呈现显著性差异（p＜0.05），复合酶质量配比为3∶1的水解度次之，但与复合酶质量配比为 1∶1、1∶2、1∶3也存在差异性（p＜0.05），而复合酶质量配比1∶2、1∶3之间差异性不显著，但与复合酶质量配比为1∶1却呈现显著性差异（p＜0.05）。由于复合酶之间的协同增效作用，复合酶的水解程度高于单一用酶，综上，后续研究选择复合酶质量配比为2∶1。

2.1.3 温度对水解度的影响

以复合酶质量配比为2∶1，按pH值6.0、底物质量浓度30 g/L、时间3 h、酶添加量3%，研究温度对水解度的影响，结果见图3。

图3 温度对水解度的影响Fig.3 Effect of temperature on the degree of hydrolysis

由图3可知，核桃蛋白水解度随温度的升高呈现先升高而后逐渐降低的趋势，在温度为40℃时，蛋白水解度达到最大，并且与其它温度梯度之间均呈现显著性差异（p＜0.05），酶解温度为45℃时的水解度与其余温度梯度之间也出现显著性差异（p＜0.05），核桃蛋白水解度仅次于40℃，此后核桃蛋白水解度下降趋势加快，究其主要原因是水解能力强的中性蛋白酶活力逐渐降低直至失活，依上述分析得出后续研究选择温度为40℃。

2.1.4 pH值对水解度的影响

以复合酶质量配比为2∶1、温度为40℃，按底物质量浓度30 g/L、时间3 h、酶添加量3%，研究pH值对水解度的影响，结果见图4。

pH值是酶活性的关键参数之一。酶作为特殊蛋白质，它的分子构像以及其所处的解离状态、底物分子的解离状态都会依据pH值的不同而发生变化[19]，进而影响酶和底物结合、催化。所以只有处于适宜的pH环境条件下，酶和要催化的底物才能处于最易于结合的状态，才能有效的对底物进行彻底催化[20]。

从图4可以看出，pH值对核桃蛋白水解程度有显著影响，在pH值为7.0时，核桃蛋白的水解程度处于最佳点，并且不同pH值之间的水解度两两之间存在显著性差异（p＜0.05），之后随着pH值偏于碱性，核桃蛋白水解程度明显下降，综上选择pH值为7.0作为后续研究所需。

2.1.5 酶添加量对水解度的影响

以复合酶质量配比为2∶1、温度为40℃、pH值为7.0，按底物质量浓度30 g/L、时间3 h，研究酶添加量对水解度的影响，结果见图5。

图4 pH值对水解度的影响Fig.4 Effect of pH on the degree of hydrolysis

图5 酶添加量对水解度的影响Fig.5 Effect of enzyme addition on the degree of hydrolysis

由图5可知，核桃蛋白的水解度随酶添加量的增大而逐渐升高，之后呈现下降趋势，虽然加酶量越多，生成的产物也就随之增加，但是酶解反应为可逆反应，生成的产物积累到一定程度时，就会反过来抑制酶解反应的进行，导致水解程度下降[21]；当酶添加量为5%时，水解程度最佳，与其它浓度梯度之间差异性均显著（p＜0.05），酶添加量7%、9%之间差异性不显著，但均与1%、3%呈现显著性差异（p＜0.05），后者两两之间也存在差异性（p＜0.05），综上选择酶的最适添加量为5%。

2.1.6 底物质量浓度对水解度的影响

以复合酶质量配比为2∶1、温度为40℃、pH值为7.0、酶添加量为5%，按时间3 h，研究底物质量浓度对水解度的影响，结果见图6。

图6 底物质量浓度对水解度的影响Fig.6 Effect of substrate mass concentration on hydrolysis degree

由图6可知，底物质量浓度能显著影响核桃蛋白水解度，底物质量浓度较低时，酶与底物不能充分接触，反应速率慢，导致水解程度较低；适当的底物质量浓度有利于促进酶解反应向产物生成的方向移动[22]；而随着底物质量浓度继续增大，产物的生成量有所降低，其原因主要是，在底物质量浓度较大时，要被催化的底物蛋白之间发生交联聚合现象[23]，导致酶与蛋白之间接触的几率减小，溶解性降低，黏度增大，引起酶解反应速率减缓，水解度下降[24]。底物质量浓度30 g/L、40 g/L之间无显著性差异，但水解度高于30 g/L，以上两者与其余浓度之间呈现差异性显著（p＜0.05），综上，选择底物的最适质量浓度为40 g/L。

2.1.7 时间对水解度的影响

以复合酶质量配比为2∶1、温度为40℃、pH值为7.0、酶添加量为5%，底物质量浓度为40 g/L，研究时间对水解度的影响，结果见图7。

图7 时间对水解度的影响Fig.7 Effect of time on the hydrolysis degree

由图7可知，核桃蛋白水解度随着酶解时间的延长呈现先上升而后逐渐趋于平缓，在酶解刚开始时，酶的活力强，产物生成量少，有利于酶解传质过程的进行[25]，所以核桃蛋白水解度上升较快，当酶解时间为4 h时，蛋白酶的活性有所下降，此时游离多肽的增多对产物的生成抑制逐渐变大[26]，核桃蛋白水解程度逐渐变得缓慢趋于平衡。从差异性看可知，酶解时间4、5、6 h两两之间不存在差异性，均与2、3 h之间呈现显著性差异（p＜0.05）。综上，选择酶解时间为4 h。

2.2 正交优化试验

在单因素试验的基础上，以温度（A）、pH值（B）、酶添加量（C）、底物质量浓度（D）、时间（E）为试验因素，蛋白水解度为考察指标，采用L16（45）正交设计研究不同因素对核桃蛋白水解度的影响，正交试验结果与分析见表2。

表2 核桃多肽制备工艺条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for walnut polypeptides preparation conditions optimization

由表2可知，以核桃蛋白水解度为评价指标时，影响核桃多肽制备工艺的因素主次为A＞B＞D＞C＞E，即温度＞pH值＞底物质量浓度＞酶添加量＞时间，其最优的试验组合为A3B3C2D2E2，即温度为40℃、pH值为7.2、酶添加量为5%、底物质量浓度为40 g/L、时间为4 h，其中温度对结果影响显著（p＜0.05）；在正交试验优化最佳条件下进行3次平行验证试验，核桃蛋白水解度为26.72%。所以，确定复合酶水解核桃饼粕蛋白制备核桃多肽的最佳制备工艺为：复合酶最佳质量配比为2∶1、温度为40℃、pH值为7.2、酶添加量为5%、底物质量浓度为40 g/L、时间为4 h。

3 结论

本文对中性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行复合对双酶水解核桃饼粕制备核桃多肽的影响因素进行研究，通过单因素和正交试验确定了核桃多肽最佳制备条件为：复合酶最佳质量配比为2∶1、温度为40℃、pH值为7.2、酶添加量为5%、底物质量浓度为40 g/L、时间为4 h，在此条件下核桃饼粕中蛋白质的水解度为26.72%。研究结果对核桃提质增效、促进核桃资源充分利用，助推贵州省核桃产业向前发展及助力国家脱贫攻坚具有重要的现实意义。

参考文献：

[1]姜莉,徐怀德,陈金海.核桃多肽功能特性的研究[J].食品科技,2013,38(1)：228-231

[2]谢翠品,敬思群,刘帅,等.黑曲霉发酵核桃粕生产核桃多肽工艺优化[J].中国酿造,2013,32(2)：53-57

[3]吕名蕊,史宣明,张骊,等.核桃多肽功能特性及制备工艺研究进展[J].中国油脂,2013,38(5)：34-38

[4]孔令明,李芳,宗玉霞,等.酶解条件对核桃多肽抗氧化活性的影响[J].食品研究与开发,2013,34(14)：106-109

[5]陈树俊,李乐,石玥,等.响应面法优化酶解制备核桃多肽工艺[J].食品工业科技,2017,38(16)：142-149,158

[6]李丽,阮金兰,钱伟亮,等.多指标评价核桃蛋白及多肽的抗氧化活性[J].食品研究与开发,2017,38(3)：1-4

[7]田娅玲.核桃抗氧化肽的制备及其分离纯化[D].贵阳：贵州大学,2016

[8]宗玉霞.核桃粕制备多肽营养液的工艺研究[D].乌鲁木齐：新疆农业大学,2013

[9]贾靖霖,刘晓丽,唐璐璐,等.多酶协同水解核桃蛋白的研究[J].食品科技,2014,39(4)：58-63

[10]李丽,刘阳,张帅,等.核桃多肽制备酶解关键技术研究[J].食品研究与开发,2016,37(15)：130-134

[11]康俊杰,陈树俊,赵瑞欢,等.核桃粕组成测定及抗氧化多肽工艺优化的研究[J].农产品加工(学刊),2014(2)：31-34,38

[12]贾靖霖,蒲云峰,李虎,等.核桃多肽抗疲劳作用的研究[J].食品工业科技,2014,35(7)：340-342

[13]贾靖霖,陆健康,汪莉莉,等.核桃多肽体外抗氧化活性研究[J].中国酿造,2014,33(5)：109-112

[14]Sun T,Ho C T.Antioxidant activities of buck weat extracts[J].Food Chemistry,2005,90(37)：745-746

[15]杜蕾蕾.冷榨核桃制备核桃油和核桃蛋白的研究[D].武汉：武汉工业学院,2009

[16]宗玉霞,杨海燕,劳菲,等.木瓜蛋白酶水解核桃粕制备抗氧化活性多肽的研究[J].中国食品添加剂,2012(4)：170-176

[17]张兴灿.核桃蛋白多肽新型酶解制备工艺的研究[D].昆明：昆明理工大学,2012

[18]高瑞雄,闫巧珍,岳珍珍,等.冷榨核桃粕液态发酵制备核桃多肽[J].食品科学,2016,37(19)：190-196

[19]林燕,陈计峦,吴继红.酶法制备核桃多肽研究进展[J].粮食与油脂,2009(1)：46-48

[20]姜莉,徐怀德,陈金海,等.核桃多肽的制备及核桃多肽酒的研制[J].食品科学,2009,30(8)：307-310

[21]GHARIBZAHEDI S M T,MOUSAVI S M,HAMEDI M,et al.Determination and characterization of kernel biochemical composition and functional compounds of Persian walnut oil[J].J Food Sci Technol,2014,51(1)：34-42

[22]李建杰,荣瑞芬.复合酶解制备核桃多肽工艺条件的优化[J].中国油脂,2011,36(1)：22-26

[23]马岩,孟宪军.核桃抗氧化多肽喷雾干燥的工艺优化[J].食品工业科技,2016,37(12)：243-249

[24]李丽,刘阳,张帅,等.核桃多肽制备酶解关键技术研究[J].食品研究与开发,2016,37(15)：130-134

[25]李丽,阮金兰,钱伟亮,等.多指标评价核桃蛋白及多肽的抗氧化活性[J].食品研究与开发,2017,38(3)：1-4

[26]YanhongLi,BoJiang,TaoZhang,et al.Antioxidant and free radicalscavenging activities of chickpea protein hydrolysate(CPH)[J].Food Chemistry,2008,106：444－450