甲硫氨酸对小鼠毛发生长和脏器指数的影响

李晓凤王 昕杨 兵张华琦

(1. 铜仁职业技术学院，贵州 铜仁 554300；2. 西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

甲硫氨酸(Met)是人和动物必需氨基酸之一，腺苷甲硫氨酸(SAM)是它的重要代谢产物之一[1]。SAM是Met通过腺苷三磷酸腺苷转移酶(MAT)催化产生的，MAT有3种主要亚型：MAT I、MAT II和MAT III[2]。SAM是基因调控至关重要的甲基供体之一[2]。DNA甲基化和蛋白质甲基化(包括组蛋白甲基化)，是在甲基转移酶催化、SAM作为甲基供体条件下完成的[3]。s-腺苷高半胱氨酸(SAH)为Met另一重要代谢产物，是通过甲基转移酶(DNMTs)催化生成的，然后由SAH水解酶(AHCY)转化为同型半胱氨酸(Hcy)[3]。因此，Met可通过以上2种代谢过程调控生物基因的甲基化状态，从而改变基因表达和生物性状。最新研究表明，Met参与骨骼微结构[4]、胶原蛋白特性[4]、胚胎干细胞维持[5]、胚胎发育[5]、葡萄糖耐受[6]和泌乳[7-8]等诸多生命过程。毛发生长周期分为生长期、退行期和休止期，该过程受到很多因素的影响，例如日照、遗传和营养等[9-11]。然而，迄今为止，关于Met对模型动物(小鼠)的毛发生长、脏器指数的影响尚未见报道。基于此，本研究通过测量、计算不同Met浓度下小鼠的毛发直径、长度以及部分脏器指数，为Met调控毛发生长及器官毒理作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小白鼠：25日龄昆明体重18～22 g，西安交通大学实验动物中心；

Met：纯度99.99%，江苏盐城品王贸易有限公司；

分析天平：BSM-220.3型，上海卓精仪器设备有限公司；

数显游标卡尺：118型，台州艾测五金专营店；

显微测微尺：0.01 mm，泰州市诚倍教学设备有限公司；

手提式中药粉碎机：BZFS-02型，西安宝正实业有限公司；

电热鼓风干燥箱：DHG9000型，上海高致精密仪器有限公司；

真空干燥器：VA250-1型，上海君翼仪器设备有限公司；

凯氏定氮仪：K1160型，济南海能仪器股份有限公司；

氨基酸自动分析仪：835-50型，日本日立公司。

1.2 试验动物与分组

80只昆明小白鼠随机分成4组，分别用0.12%(基础日粮)，0.80%，1.60%，2.40%的Met处理，每组5个重复，每个重复雌、雄鼠各2只。试验小鼠自由采食、饮水，笼养，每2 d 更换小鼠垫料。饲养室定时通风、采光，温度控制在24 ℃左右，相对湿度60%左右。每天观察记录小白鼠采食、饮水、生长发育以及健康状况。

1.3 基础日粮原料组成及养分测定

(1) 基础日粮水分：按GB/T 5009.3—2010执行。

(2) 干物质：按式(1)计算干物质。

(1)

式中：

D——干物质含量，%；

m1——烘干前样品重量，g；

m2——105 ℃ 5 h烘干后样品重量，g。

(3) 蛋白质：按GB 5009.5—2016执行。

(4) 脂肪：按GB/T 5009.6—2003执行。

(5) 灰分：按GB/T 5009.4—2010高温灰化法执行。

(6) 能量：按GB 28050—2011和GB/Z 21922—2008执行。

(7) 氨基酸含量：采用日立835-50型氨基酸自动分析仪测定。

1.4 毛发直径、长度的测量

在毛发退行期、休止期，每组采集10只小鼠左肩胛部毛发，分别采用显微测微法测定毛发纤维直径，采用数显游标卡尺测定毛发自然长度。每只小鼠个体分别测定、记录30根毛发的直径、长度。

1.5 脏器指数的测定

在毛发退行期、休止期，每组断髓处死雄鼠、雌鼠各5只，剥离心脏、脾脏、肺脏、肝脏、胸腺和肾脏等，准确称量并记录，计算各脏器的脏器指数。脏器指数按式(2)计算:

(2)

式中：

R——脏器指数；

w1——某一脏器重量，g；

w2——动物活体重量，g。

1.6 数据分析与统计

2 结果与分析

2.1 基础日粮组成、营养水平及氨基酸含量

基础日粮的原料组成、营养水平以及氨基酸含量分别见表1、2、3。

2.2 日粮Met对毛发生长的影响

毛发生长周期包括生长期、退行期和休止期，该过程受到诸多因素的影响，例如日照、遗传及营养等[9-11]。由图1可知，0.80%，1.60%，2.40% 3种处理显著降低退行期毛发直径，显著降低退行期、休止期毛发长度(P<0.05)。退行期，0.80%，1.60%，2.40% 3种处理的毛发直径显著低于0.12% 处理的(P<0.05)，0.80%，1.60% 2种处理的显著低于2.40%处理的(P<0.05)，但0.80%与1.60% Met组差异不显著(P>0.05)；休止期，各处理组毛发直径差异不显著(P>0.05)；退行期，0.80%，1.60% 2种处理的毛发长度显著低于0.12%和2.40%处理的(P<0.05)，但0.80%处理与1.60%处理、0.12% 处理与2.40%处理的毛发长度差异不显著(P>0.05)；休止期，0.80%，1.60% 2种处理的毛发长度显著低于0.12%和2.40%处理的(P<0.05)，且1.60%处理的显著低于0.80%处理的(P<0.05)，但0.12%处理与2.40%处理的毛发长度差异不显著(P>0.05)。Zhang等[12]在蛋白质含量为24%日粮中添加0.74%Met，显著提高貂的毛发长度与直径(P<0.05)，与本研究结果恰好相反，此种现象差异可能是日粮中蛋白质水平、各种氨基酸含量、平衡状态的差异或者三者共同作用的结果。另外，高浓度日粮Met可能增加机体整体甲基化程度，从而改变毛发生长密切相关的基因表达模式，最终抑制毛发生长[12]。

表1 基础日粮的原料组成

表2 基础日粮的营养价值(风干物质)

表3 基础日粮的氨基酸含量(风干基础)

*表示组间差异显著(P<0.05)

2.3 日粮Met浓度对小鼠脏器指数的影响

研究表明，Met浓度对机体肝脏代谢和健康具有重要影响[13]。由图2(a)可知，日粮Met浓度对小鼠毛发退行期心指数、肝指数和胸腺指数无显著影响(P>0.05)，但对其他脏器指数有不同程度的影响。0.12%，0.80%，2.40% 3种处理的肝指数差异不显著(P>0.05)，但1.60%处理的肝指数有增加趋势(P=0.052)；0.80%，1.60%，2.40% 3种处理的脾指数显著高于0.12%处理的(P<0.05)，但前三者差异不显著(P>0.05)； 0.80%，1.60% 2种处理的肺指数显著高于0.12%和2.40%处理的(P<0.05)，但0.80%处理与1.60%处理、0.12% 处理与2.40%处理的差异均不显著(P>0.05)；0.80%，1.60%，2.40% 3种处理的肾指数显著高于0.12%处理的(P<0.05)，但前三者差异亦不显著(P>0.05)；各处理组心指数、胸腺指数差异不显著(P>0.05)。

由图2(b)可知，日粮Met浓度对小鼠毛发休止期心指数、脾指数无显著影响(P>0.05)，但对其他脏器指数有不同程度影响。0.80%，1.60%，2.40% 3种处理的肝指数显著低于0.12%处理的(P<0.05)，但前三者之间差异不显著(P>0.05)； Sanchez-Roman等[14]对老年大鼠进行日粮Met限制，发现肝脏线粒体活性氧的产生减少，逆转了机体衰老状况。Eriksson等[15]发现日粮Met对维持小鼠肝脏细胞质还原状态是必须的。本研究发现，休止期高浓度(0.80%和1.60%)Met显著降低肝指数，即肝脏发生萎缩现象，可能是高浓度Met对肝细胞的毒性作用，影响到肝细胞的增殖和凋亡。

由图2(b)可知，1.60%处理的肺指数、肾指数显著高于0.12%，0.80%，2.40% 3种处理的(P<0.05)，但后三者之间差异不显著(P>0.05)；1.60%，2.40% 2种处理的胸腺指数显著高于0.80%处理的，2.40%处理的胸腺指数显著高于0.12% 处理的(P<0.05)，但0.12%处理和1.60%处理的胸腺指数差异不显著(P>0.05)；各处理组心指数、脾指数差异不显著(P>0.05)。研究[16-17]表明，过量Met显著降低肾脏的抗氧化能力，增加肾脏活性氧(ROS)的积累。Cooke等[16]研究显示，Met小鼠肾脏涉及离子转运的基因(Aqp2、Scnn1a、和Slc6a19等)发生上调受到限制，而这些基因参与维持渗透压平衡，另外小鼠肾脏渗透压的改变是肾脏发生萎缩或水肿的重要原因之一。本研究结果显示：高浓度(0.80%和1.60%)Met显著提高肾脏指数，即肾脏发生水肿现象，与Cooke等[16]研究基本相符，可能的机制是高浓度Met使维持肝脏渗透压的基因(Aqp2、Scnn1a和Slc6a19等)表达发生变化，从而发生水肿。

*表示组间差异显著(P<0.05)

2.4 性别对不同日粮Met浓度条件下休止期小鼠脏器指数的影响

由图3可知，日粮Met浓度为1.60%时，雌鼠心指数显著高于雄鼠(P<0.05)，其他Met浓度条件下差异不显著(P>0.05)；日粮Met浓度为0.12%时，雌鼠肝指数显著高于雄鼠(P<0.05)，其他Met浓度条件下差异不显著(P>0.05)；日粮Met浓度为0.12%，2.40%时，雄鼠肝脾指数显著高于雌鼠(P<0.05)，但日粮Met浓度为1.60%时，雌鼠肝脾指数显著高于雄鼠(P<0.05)；雄鼠、雌鼠肺指数在不同硫氨酸浓度条件下无显著差异，且肺指数具有相同的变化规律，即先升高后降低，当Met浓度为1.60%时，达到峰值(P>0.05)；当Met浓度为1.60%，2.40%时，雌鼠肾指数显著高于雄鼠，其他Met浓度条件下差异不显著(P>0.05)；在Met为0.12%，0.80%，1.60%，2.40%时，雄、雌鼠胸腺指数无显著差异(P>0.05)。陈华等[18]研究表明，性别对Wistar大鼠、SD大鼠的心指数、肾指数和肝指数均无显著性影响，但雄鼠的肺指数显著低于雌鼠(P<0.05)，另外SD雄鼠的脾指数显著低于雌鼠(P<0.05)。与本研究结果不一致，由此推测，Met浓度与性别可能存在互作关系，从而改变机体脏器指数。

*表示组间差异显著(P<0.05)

3 结论

本研究通过不同Met浓度日粮处理小鼠，发现0.80% 和1.60% Met均显著降低退行期、休止期毛发直径和长度，且显著提高退行期脾指数、肺指数和肾指数，原因可能是Met浓度改变了机体整体甲基化状态以及脏器渗透压调节相关的基因表达状态。然而，具体的分子调控机制尚不清楚，有待进一步研究。

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