襄麦冬总甾体皂苷提取工艺优化及体外清除自由基活性评价

杨佳娣 柯 婉 叶国栋 潘婉莲 于 博 余海忠

(湖北文理学院化学工程与食品科学学院，湖北 襄阳 441053)

襄麦冬学名湖北麦冬(Liriopespicatavar.prolifera)，为百合科山麦冬属植物，其块根与川麦冬、杭麦冬一起入药，连续收载于《中华人民共和国药典》(1995，2000，2005，2010，2015年版)，是国家地理标志产品。甾体皂苷是襄麦冬的主要活性成分之一，在医学研究、保健品开发、食品生产等方面应用广泛[1]。目前，对襄麦冬甾体皂苷的研究，主要集中在成分或含量测定方面。张炜等[2]建立了UPLC-MS/MS法检测妇康宁片中掺加的湖北麦冬皂苷；吴发明等[3]从中国四大产地的麦冬中均检出麦冬皂苷D，但浙江麦冬含量较低；同时也发现不同产地麦冬中4种有效组分(2个皂苷和2个黄酮)的含量差异极显著[4]。陈乃东等[5]证明高效毛细管电泳法可用于25R与25S-鲁斯可皂苷元手性拆分，为鲁斯可皂苷元药理学研究、质量控制提供了新方法。吴弢等[6]采用ELSD测定了湖北麦冬中山麦冬皂苷 B的含量，结果表明ELSD是皂苷类化合物较为适宜的检测器。林以宁等[7]采用HPLC-ELSD法测定发现不同种麦冬类药材在皂苷元组成及含量上均有区别，其总苷元含量为：短葶山麦冬>川麦冬和湖北麦冬>杭麦冬。

也有学者开展了一些皂苷与其品质相关性的研究。王小刚[8]发现山麦冬皂苷B的含量在不同种苗间无显著差异，但是与土壤中有效磷和全钾呈显著性相关。兰宏昌[9]以山麦冬皂苷B含量等5个因素为考核指标，分析不同施加时间、不同施加剂量的多效唑对湖北麦冬质量和产量的影响，得出多效唑的合适施用量为0.84 g/m2，最佳施用时间为9月中下旬。朱业芹[10]以山麦冬皂苷B和多糖的含量作为质量评价指标，确定了以具有粗根、新生芽的植株为种苗，株距×行距(10 cm×15 cm)种植，摘花葶处理时的湖北麦冬质量和产量较优。

此外，在甾体皂苷的细胞活性评价、降血糖方面也有一些报道。林以宁等[7]发现不同种麦冬类药材均对中性粒细胞呼吸爆发呈抑制作用，其中，短葶山麦冬对中性粒细胞的呼吸爆发具有较强的抑制作用。刘霞等[11-12]证实了湖北麦冬所含总多糖和总皂苷均具有降血糖作用，降糖效果为湖北麦冬总多糖>湖北麦冬总皂苷>湖北麦冬总提取物。

目前，关于襄麦冬的皂苷提取研究报道较少，仅见林韵涵[13]与刘霞[11,14]的报道。前者通过正交试验获得总皂苷最佳提取工艺的得率为18.67%；后者则利用大孔吸附树脂分离、纯化襄麦冬块根提取物，得到纯度含量为66.52%的总多糖和81.15%的总皂苷。而对襄麦冬甾体皂苷的抗氧化活性研究则更为鲜见，仅见其不同极性部位粗提物的[15]，尚未见单一类组分——总甾体皂苷的体外抗氧化活性报道。同时，从植物中寻找天然抗氧化物质已逐渐成为食品行业关注的热点[16-17]，作为药食兼用的襄麦冬，不仅具有较好的药理与保健作用，还被广泛用于食品开发，目前已有麦冬酒、麦冬茶、麦冬咀嚼片、麦冬酸奶等产品问世[18-19]。

基于上述，本试验拟通过响应面法优化襄麦冬总甾体皂苷的提取工艺，并采用α-脱氧核糖法、邻苯三酚自氧化法、DPPH法、ABTS法测试其体外抗氧化能力，以期能为天然抗氧化剂的开发提供一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

襄麦冬块根：襄麦冬原产地——湖北襄阳欧庙，新鲜块根洗净后60 ℃烘干至恒重，粉碎待用；

α-脱氧核糖、硫代巴比妥酸、邻苯三酚、ABTS、生育酚、甲醇等：分析纯，国药集团上海化学试剂有限公司；

DPPH：分析纯，美国Sigma公司；

山麦冬皂苷B标准品：分析纯，中国食品药品检定研究院；

微型植物粉碎机：FZ102型，天津泰斯特仪器有限公司；

数显鼓风干燥箱：GZX-9240 MBE型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；

紫外-可见光分光光度计：UV-1800型，日本岛津公司；

高效液相色谱仪：LC-20AT型，日本岛津公司；

超声波清洗器：KH3200DB型，昆山禾创超声仪器有限公司；

小型冷冻干燥机：FreeZone 12型，美国Labconco公司。

1.2 襄麦冬总甾体皂苷的提取

分别称取1.0 g襄麦冬块根粉碎物，加入一定体积甲醇进行超声处理，在设定的温度下提取一定时间后，过滤。滤渣转移至索氏提取器内，加入100 mL甲醇，80 ℃恒温水浴，继续提取一定时间后停止，合并2次滤液，减压浓缩得浸膏。取100 mL纯水常温超声溶解浸膏，过滤，滤液中加入40 mL乙醚进行萃取脱酯。对保留的水层部分，依次加入15，10，5，5 mL水饱和正丁醇，分4次萃取样品溶液，合并萃取的正丁醇层部分，依次进行45 ℃水浴减压浓缩和-40 ℃真空冷冻干燥，所得产物即为襄麦冬总甾体皂苷。

1.3 甾体皂苷的HPLC含量测定

以山麦冬皂苷B的含量来示踪襄麦冬块根提取物中的总甾体皂苷含量，HPLC检测条件：检测器SPD-M20A，色谱柱Inert Sustain C18，柱温箱CTO-20A，真空脱气机DGU-20A3，流动相85%甲醇，流速0.3 mL/min，检测波长208 nm，进样量10 μL，等度洗脱40 min。用甲醇将山麦冬皂苷B标准品配制成0.125，0.250，0.050，0.750，1.000 mg/mL 的溶液，上机检测后以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标制作标准曲线(图1)，得到回归方程y=7.99×106x-1.08×106，R2=0.995。

1.4 襄麦冬总甾体皂苷的提取单因素试验设计

1.4.1 液料比对得率的影响 各取1 g样品，分别按液料比10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1 (mL/g)与甲醇混合，30 ℃超声处理1.0 h后转入索氏提取1.0 h。最后对样品进行萃取、浓缩、干燥，用30 mL甲醇溶解定容即得总甾体皂苷溶液，测定其含量。

1.4.2 超声处理温度对得率的影响 各取1 g样品，按液料比20∶1 (mL/g)与甲醇混合，分别在25，30，35，40，45，50 ℃下超声处理1.0 h后转入索氏提取1.0 h。最后对样品进行萃取、浓缩、干燥，用30 mL甲醇溶解定容即得总甾体皂苷溶液，测定其含量。

1.4.3 超声处理时间对得率的影响 各取1 g样品，按液料比20∶1 (mL/g)与甲醇混合，30 ℃分别超声处理0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 h后转入索氏提取1.0 h。最后对样品进行萃取、浓缩、干燥，用30 mL甲醇溶解定容即得总甾体皂苷溶液，测定其含量。

图1 山麦冬皂苷B的HPLC色谱图及标准曲线

1.4.4 索氏提取时间对得率的影响 各取1 g样品，按液料比20∶1 (mL/g)与甲醇混合，30 ℃超声提取1.0 h后转入索氏提取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 h。最后对样品进行萃取、浓缩、干燥，用30 mL甲醇溶解定容即得总甾体皂苷溶液，测定其含量。

1.5 甾体皂苷的抗氧化活性测试

1.5.1 清除OH自由基的活性测试 采用α-脱氧核糖法[20]。取不同的具塞试管，分别依次加入0.20 mL的FeSO4-EDTA溶液(10 mmol/L)、0.20 mL的α-脱氧核糖溶液(10 mmol/L)、1 mL不同浓度的样品溶液、0.4 mL磷酸缓冲液(pH 7.4，0.1 mol/L)和0.20 mL H2O2(10 mmol/L)，混匀，37 ℃水浴1 h后，再依次加入1 mL的2.8 g/100 mL三氯乙酸溶液和1.0 mL的1.0 g/100 mL硫代巴比妥酸溶液，迅速摇匀，100 ℃水浴10 min，冷水冷却后在532 nm处测定吸光值AS。不加样品溶液，同上操作处理，测定其对比吸光值AC。不加样品溶液且不在37 ℃水浴中反应，其它处理同上，测定空白吸光值A0。每个样品重复3次，清除率按式(1)计算：

S=[1-(AS-A0)/(AC-A0)]×100%，

(1)

式中：

S——清除率，%；

AS——样品吸光值；

A0——空白吸光值；

AC——对比吸光值。

S=(Ac-As)/Ac×100%，

(2)

式中：

S——清除率，%；

Ac——对照吸光值；

As——样品吸光值。

1.5.3 清除DPPH自由基的活性测试 采用DPPH法[22]。取不同的具塞试管，分别依次加入3.9 mL的DPPH甲醇溶液(25 mg/L)和0.1 mL不同浓度的样品，混匀，将试管放入暗处反应30 min后，立刻取出测定其在515 nm处吸光值，空白用甲醇替代样品溶液，其它操作相同。每个样品重复3次，清除率按式(3)计算：

S=[(A0-As)/A0]×100%，

(3)

式中：

S——清除率，%；

As——样品吸光值；

A0——空白吸光值。

1.5.4 清除ABTS自由基的活性测试 采用ABTS法[23]。取0.2 mL的ABTS(7.4 mmol/L)溶液，加入0.2 mL的K2S2O8(2.6 mmol/L)溶液，混匀，室温避光静置12 h，用95%乙醇稀释40倍，此时在734 nm处测得吸光值为0.7±0.02即可。取不同的具塞试管，分别加入0.8 mL上述溶液和0.2 mL 不同浓度的样品溶液，剧烈振摇10 s，充分混合，静置6 min，立刻测定其在734 nm处吸光值。空白用乙醇代替，每个样品重复3次，清除率按式(4)计算：

S=(1-AS/A0)×100%，

(4)

式中：

S——清除率，%；

AS——样品吸光值；

A0——空白吸光值。

1.6 数据处理

响应面试验设计与数据处理采用Design-expert 8.0.6进行，其它数据采用Origin Pro 8.5进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

目前，已从襄麦冬块根中分离出包括山麦冬皂苷B在内的14种结构的甾体皂苷[24]。本试验以山麦冬皂苷B含量为示踪指标。

2.1.1 液料比对得率的影响 由图2(a)可知，液料比对甾体皂苷含量影响较大。总体上看，在设定的范围内液料比为20∶1 (mL/g)时，提取物中山麦冬皂苷B的含量最大，达到0.069 2 mg/mL。此时，也意味着提取的甾体皂苷的含量最大。

2.1.2 超声处理温度对得率的影响 由图2(b)可知，超声温度对山麦冬皂苷B的影响趋势与液料比的类似，也是先增加后减小，可能与襄麦冬块根中富含多糖有一定的关系，在加热的情况下，样品粉末自身携带的少量水分与富含多糖的块根粉末糊化，形成胶体，阻挡了部分甲醇与甾体皂苷分子的充分接触，影响了甾体皂苷的进一步溶解。

2.1.3 超声处理时间对得率的影响 由图2(c)可以看出，超声处理时间对甾体皂苷的提取含量的影响比较小，提取物中山麦冬皂苷B的平均含量维持在0.058 5 mg/mL左右，因此，取0.5 h作为超声处理时间。

2.1.4 索氏提取时间对得率的影响 由图2(d)可知，在3 h之前，随着提取时间的延长，山麦冬皂苷B的含量也随之提高，达到3 h之后，提取含量的增幅减小，甾体皂苷的含量趋于稳定。因此，考虑提取时间成本，选择3 h作为最佳索氏提取时间。

2.2 响应面法试验结果

2.2.1 响应面法试验设计及结果 利用Design-expert软件，结合单因素试验结果，在超声处理0.5 h的基础上，选择液料比、超声处理温度、索氏提取时间3个为影响因素，分析各因素及因素间对提取物中山麦冬皂苷B含量的影响，试验设计及结果分别见表1、2。

图2 处理因素对襄麦冬总甾体皂苷含量的影响

2.2.2 方差分析 利用软件对表2试验数据进行多元回归比拟，得出甾体皂苷含量(Y)对超声处理液料比、超声处理温度和索氏提取时间的二次多项回归方程为：

Y=-0.221 65+0.008 435A+0.008 79B+0.025 35C+3E-06AB-0.000 485AC-0.000 185BC-0.000 182 5A2-0.000 104 5B2-0.001 262 5C2。

(5)

由表3可以看出，模型P=0.000 3<0.01，说明此回归模型极显著；失拟误差P=0.797 1>0.05，说明检验结果与模型计算结果不存在显著差异，相关系数R2=0.964 2，说明96.42% 的试验数据的变异性可以用此回归模型解释，和实际情况拟合程度较好。因此，该方程可用于分析和预测襄麦冬块根总甾体皂苷的提取工艺。

2.2.3 主效应分析 对试验数据进行方差分析，结果见表3。根据各因素变量的显著性检验，可以看出：C因素的显著水平P<0.01，说明索氏提取时间对甾体皂苷含量的影响极显著；A因素的显著水平P<0.05，说明超声液料比对甾体皂苷含量的影响显著；而B因素显著水平0.193 2>0.05，即超声处理温度对甾体皂苷含量的影响不显著，因此，各因素对甾体皂苷含量的影响主次顺序为：C>A>B。

表1 Box-Behnken设计的因素水平表

表2 Box-Behnken的试验设计及结果

Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken center composite

试验号ABC甾体皂苷含量/(mg·mL-1)11010.069 320110.070 830000.073 340000.072 150000.074 16-1010.070 67-1-100.063 3801-10.066 891-100.065 3101100.067 11110-10.067 212-1100.064 8130000.071 2140-110.071 9150-1-10.064 216-10-10.058 8170000.070 8

2.2.4 两因素间的交互效应分析 保持1个因素为最优条件，对其它2个因素间的交互效应进行分析，它们与响应值的关系用三维空间响应面图和三维等高线图表示，具体见图3。

图3(a)、(b)显示的是超声处理温度与液料比对甾体皂苷含量的影响。随着温度和液料比的增加，甾体皂苷含量均有一个先逐渐升高后逐渐降低的过程。图3(c)、(d)显示的是索氏提取时间与液料比对甾体皂苷含量的影响。当固定液料比在某一值时，随着索氏提取时间的延长，甾体皂苷含量逐渐升高；当固定索氏提取时间在某一值时，随着液料比的升高，甾体皂苷含量先增加后减少。图3(e)、(f)显示的是索氏提取时间与超声处理温度对甾体皂苷含量的影响，它们之间的交互影响趋势与图3(c)、(d)类似。

表3 各因素的回归系数及影响因子的显著性†

† *：P<0.05，显著；**：P<0.01，极显著；R2=0.964 2。

图3 两因素间的交互效应分析

2.2.5 响应面最佳条件的选择及验证 利用软件对襄麦冬总甾体皂苷提取工艺进行响应面分析，得出最佳提取条件为：超声处理时间0.5 h、液料比19.45∶1 (mL/g)、超声处理温度39.68 ℃、索氏提取时间3 h，此时，提取物中甾体皂苷含量最高，达到0.074 3 mg/mL。为了验证预测值是否准确，同时考虑到实际操作的便利，将最佳条件调整为：超声处理时间0.5 h、液料比19.5∶1 (mL/g)、超声处理温度39.7 ℃、索氏提取时间3 h。在此条件下，进行3次平行实验，结果测得的甾体皂苷含量为0.073 8 mg/mL，与预测值相差0.000 5，非常接近。这证明二次多元回归模型的预测值与实际值吻合良好，具有较高的可信度和实用价值。本试验主要考察响应面法在襄麦冬甾体皂苷提取条件上的优化应用，对样品采用甲醇溶解辅以超声处理、80 ℃索氏提取、萃取、减压浓缩和冷冻干燥等处理步骤，获得最佳工艺下的提取得率为22.14%，比林韵涵等[13]报道的通过正交试验优化的提取得率(18.67%)高出近4%，证明采用响应面法优化可有效提高襄麦冬甾体皂苷的得率。

2.3 自由基清除活性的评价

2.3.1 清除OH自由基的活性测试 图4(a)显示的是甾体皂苷对OH自由基的清除活性变化情况：在较低浓度范围内，清除率随着浓度的增加而急剧升高；但是当浓度达到一定数值后，清除率虽然仍随浓度的增加而升高，但是升高的趋势减缓，这种变化趋势与阳性对照生育酚类似。在设定的最高浓度为1.28 mg/mL时，清除率达到最高(59.66%)，表明襄麦冬甾体皂苷对OH自由基具有较强的清除能力。

2.3.3 清除DPPH自由基的活性测试 图4(c)显示的是襄麦冬甾体皂苷对DPPH自由基的清除活性。虽然随着样品浓度的升高而呈逐步加强的趋势，但是总体上看，相较于阳性对照生育酚，其清除能力并不强，在设置的最高浓度1.28 mg/mL时，清除率也仅为10.5%。

2.3.4 清除ABTS自由基的活性测试 由图4(d)可知，同清除DPPH自由基活性一样，襄麦冬甾体皂苷对ABTS自由基的清除能力也较弱，在设置的最高浓度1.28 mg/mL时，清除率也仅为28.7%。

图4 襄麦冬甾体皂苷对不同自由基的体外清除活性评价

3 结论

本试验以湖北道地药材——襄麦冬块根为研究材料，采用响应面法优化了总甾体皂苷提取工艺，并对提取物的体外清除自由基能力进行了评价。结果表明，当采用超声处理时间0.5 h、液料比19.5∶1 (mL/g)、超声处理温度39.7 ℃、索氏提取时间3 h处理襄麦冬块根粉碎物时，提取物中甾体皂苷含量最高，此时，山麦冬皂苷B可达到0.073 8 mg/mL，即30 mL的提取物溶液中山麦冬皂苷B的含量为2.21 mg，提取得率达到22.14%。

本试验对襄麦冬甾体皂苷所做的提取工艺优化，仅仅是采用响应面法进行的前期实验室研究，考虑到工业生产应用实际，下一步的工作将从提取、分离、纯化融合工艺参数优化，以及降低生产成本等方面展开，以期能建立一套产能高、成本低的成熟生产工艺。

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