虎杖苷对动脉粥样硬化ApoE—/—小鼠血管功能的影响

林园园

[摘要]目的 研究虎杖苷對动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠血管功能的影响。方法 选取高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠16只，制备动脉粥样硬化小鼠模型。将造模后的小鼠随机分为模型组、实验组，每组8只；且随机抽取8只SPF级C57/BL6小鼠为对照组。实验组采用虎杖苷进行16周的治疗，模型组和对照组不做治疗。采集治疗前后各组小鼠的血清，用酶联免疫吸附试验检测总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL-c）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素1（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、超敏C-反应蛋白（hs-CRP）、总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、高密度脂蛋白（HDL-c）、超氧化物歧化酶（SOD）、白细胞介素-10（IL-10）。治疗周期结束后，制作小鼠动脉血管组织切片，采用油红O染色法，比较各组小鼠动脉血管的斑块面积比。结果 模型组和实验组治疗前的TC、TG、LDL-c、TNF-α、IL-1β、IL-6、hs-CRP、T-AOC、MDA、MCP-1水平高于对照组，HDL-c、SOD、IL-10水平低于对照组（P<0.05）。实验组小鼠治疗后的TC、TG、LDL-c、TNF-α、IL-1β、IL-6、hs-CRP、T-AOC、MDA、MCP-1水平低于模型组，HDL-c、SOD、IL-10水平高于模型组（P<0.05），且实验组动脉血管斑块面积显著减少（P<0.05）。结论 虎杖苷对动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠有一定的缓解和预防作用，能有效降低血脂，降低炎性细胞因子、趋化因子，增加血清免疫功能。

[关键词]动脉粥样硬化；虎杖苷；血脂；趋化因子；血管功能

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）4（b）-0021-04

Influence of Polydatin on vascular function in the ApoE-/- mice with atherosclerosis

LIN Yuan-yuan

Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Hubei Province，Wuhan 430074，China

[Abstract]Objective To study the influence of Polydatin on vascular function in the ApoE-/- mice with atherosclerosis.Methods To prepare the mouse model with therosclerosis，16 ApoE-/- mice with high fat diet were selected.The model mice were randomly divided into the model group and the experimental group，and 8 normal mice were chosen as the control group.The experimental group was treated with Polydatin for 16 weeks，while the model group and the control group was not treated.After and before the treatment，the serum was collected，and the triglyceride （TG），low density lipoprotein （LDL-c），tumor necrosis factor α （TNF-α），interleukin 1β （IL-1β），interleukin 6 （IL-6），high sensitive C-reactive protein （hs-CRP），total antioxidant capacity （T-AOC），malondialdehyde （MDA），monocyte chemoattractant protein-1 （MCP-1），high density lipoprotein （HDL-c），superoxide dismutase （SOD） and interleukin 10 （IL-10） were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）.The tissue sections of mouse arterial blood vessels were made and the plaque area ratio of arterial blood vessels in each group was compared by oil red O staining.The plaque area ratio of arterial vessels in each group was compared.Results Before the treatment，compared with the control group，the level of TC，TG，LDL-c，TNF-α，IL-1β，IL-6，hs-CRP，T-AOC，MDA，MCP-1 in serum from the model group and the experimental group were significantly increased （P<0.05）；the level of HDL-c，SOD and IL-10 of that were significantly reduced （P<0.05）.After the treatment，compared with the model group，the level of TC，TG，LDL-c，TNF-α，IL-1β，IL-6，hs-CRP，T-AOC，MDA and MCP-1 in serum from the experimental group were significantly lower，and the HDL-c，SOD and IL-10 increased significantly （P<0.05）.And the area of arterial plaque decreased significantly （P<0.05）.Conclusion The Polydatin may relieve and prevent certain effect on atherosclerosis in ApoE-/- mice，reduce blood fat，inflammatory cytokines，chemokines，and increase serum immune function.

[Key words]Atherosclerosis；Polydatin；Blood lipids；Chemokines；Vascular function

心脑血管疾病是发病率较高的疾病。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是导致心脏病、脑卒中等心脑血管疾病的主要原因[1]，其病理基础为脂质代谢紊乱、胆固醇和三酰甘油（TG）的沉积以及血管的慢性炎症病变[2]。过量的脂质引起细胞的凋亡，从而释放出脂质，形成粥样斑块[3-4]。在我国，随着人口比例的老龄化趋势，心脏病、脑卒中等疾病的发病率逐年上升，对人们的生命财产造成损失[5]。虎杖苷（Polydatin）的主要成分为白黎芦醇和葡萄糖的结合产物，主要从蓼科蓼属虎杖的根茎中提取，具有强心、改善微循环的功效[6-8]。本研究以ApoE-/-小鼠为对象，以高脂食物喂养，构建AS模型，采用虎杖苷治疗，旨在观察虎杖苷对AS ApoE-/-小鼠血管功能的影响，探讨虎杖苷对患有AS病症小鼠的影响。

1对象与方法

1.1实验对象

ApoE-/-小鼠品系C57/BL6，（购于北京华阜康生物科技股份有限公司），无处理的SPF级C57/BL6小鼠与ApoE-/-小鼠无遗传差异，体重（19.3±0.6）g，饲养温度为（25±1）℃。

1.2试剂和仪器

虎杖苷（Sigma，产品编号 15721），胆固醇（Sigma，产品编号 200-353-2），Leica 1900 冰冻切片机（德国 Leica），酶标仪（美国 Bio-Tek）。

1.3模型建立和分组

本实验分为对照组、模型组、实验组。实验共有SPF级C57/BL6小鼠8只，ApoE-/-小鼠16只。随机抽取的16只ApoE-/-小鼠，用普通配方饲料暂养1周后，投喂高脂配方饲料（含1.5%胆固醇，15.0%脂肪酸，83.5%普通饲料），连续喂养12周，随机选取造模成功的8只ApoE-/-小鼠组成实验组，以虎杖苷药物治疗，每天灌胃0.2 g/kg；剩下8只小鼠不做治疗，组成模型组。随机选取8只无遗传差异C57/BL6小鼠作为对照组，投喂普通饲料，并给予同等剂量的生理盐水，治疗持续16周。

1.4检测指标

测定治疗前后每组小鼠血清中的总胆固醇（TC）、TG、低密度脂蛋白（LDL-c）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素1（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、超敏C-反应蛋白（hs-CRP）、总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、高密度脂蛋白（HDL-c）、超氧化物歧化酶（SOD）、白细胞介素-10（IL-10）等各项指标，采样前禁食12 h，眼眶取血，离心分离后，取上清液，按照ELISA试剂盒（购买于南京建成生物工程研究所）说明书的步骤检测以上指标。

各组给药结束后，用乙醚麻醉小鼠后开胸，以0.01 mol/L的PBS液经心室灌流，取胸腔主动脉根部，制作80张冷冻切片，每隔5张进行油红O染色，并做面积变量分析，用Image Pro Plus 6.0（Media Cybernetics USA）软件分析斑块面积，并计算斑块占血管面积比。

本文对动物的处理均符合湖北省中医院所制订的有关实验动物保护和使用的指南，并经本单位实验动物伦理委员会批准。

1.5统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，计数资料以率表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1小鼠血清中脂质含量变化的比较

模型组和实验组治疗前的TC、TG、LDL-c水平均高于对照组，HDL-c水平低于对照组（P<0.05）。模型组治疗后的TC、TG、LDL-c水平均高于治疗前，HDL-c水平低于治疗前（P<0.05）。实验组治疗后的TC、TG、LDL-c水平均低于模型组，HDL-c水平高于模型组（P<0.05）（表1）。

表1 小鼠血清中脂质含量的比较（g/L，x±s）

与同组治疗前比较，▲P<0.05；与对照组治疗前比较，*P<0.05；与模型组治疗后比较，#P<0.05

2.2各组小鼠炎性细胞因子和免疫能力的比较

模型組和实验组小鼠治疗前的TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于对照组，IL-10水平低于对照组（P<0.05）。模型组治疗后的TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于治疗前，IL-10水平低于治疗前（P<0.05）；实验组治疗后的TNF-α、IL-1β、IL-6水平均低于模型组（P<0.05），IL-10水平高于模型组（P<0.05）（表2）。

表2 各组小鼠血清的炎性细胞因子和免疫能力的比较（ng/L，x±s）

与同组治疗前比较，▲P<0.05；与对照组治疗前比较，*P<0.05；与模型组治疗后比较，#P<0.05

2.3血清抗氧化能力的比较

与对照组治疗前比较，模型组和实验组治疗前的T-AOC和MDA含量均高于对照组，SOD低于对照组（P<0.05）。模型组小鼠治疗后的T-AOC和MDA含量均高于治疗前，SOD低于治疗前（P<0.05）。实验组治疗后的MDA低于模型组（P<0.05），SOD高于模型组（P<0.05）（表3）。

表3 各组小鼠血清抗氧化能力的比较（x±s）

与同组治疗前比较，▲P<0.05；与对照组治疗前比较，*P<0.05；与模型组治疗后比较，#P<0.05

2.4各组小鼠血清中黏附分子的比较

与对照组治疗前比较，模型组和实验组小鼠治疗前的MCP-1、ICAM-1、VCAM-1水平高于对照组（P<0.05）。模型组治疗后的MCP-1、ICAM-1、VCAM-1水平均高于治疗前（P<0.05）。治实验组治疗后的MCP-1、ICAM-1、VCAM-1水平低于模型组（P<0.05）（表4）。

2.5各组小鼠血清中趋化因子的比较

模型组和实验组治疗前的PCT和hs-CRP水平高于对照组（P<0.05）；模型组治疗后的PCT和hs-CRP水平高于治疗前（P<0.05）。实验组治疗后的PCT、hs-CRP水平低于模型组（P<0.05）（表5）。

2.6小鼠动脉斑块的比较

实验组治疗后的主动脉斑块面积低于模型组（P<0.05）（表6）。

表6 各组小鼠主动脉斑块的比较（x±s）

与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3讨论

动脉血管粥样硬化的诱因是多方面的，最主要的诱因是三酰甘油代谢紊乱，在动脉血管粥样硬化炎性病变的初期，内皮功能损伤，进而刺激机体产生炎性细胞因子（IL-6、TNF-α、IL-1β等）、黏附分子（如ICAM-1和VCAM-1等）、趋化因子（如MCP-1）等[9-10]。投喂高脂食物的ApoE-/-小鼠血清中TC、TG、HDL-c和LDL-c含量均显著升高。在虎杖苷的作用下，ApoE-/-小鼠血清中TC、TG、HDL-c和LDL-c含量均显著下降。血管的炎症反应可能是诱导AS斑块的主要原因[11]。炎症细胞因子能损伤内皮，促进蛋白溶解，降低其修复作用，增加斑块的不稳定性。当小鼠血清中hs-CRP、TNF-α和IL-6含量较高时，可造成血管内膜损伤、血管痉挛，并导致斑块脱落[12]。TNF-α是一种非糖基化转膜蛋白，可介导炎症反应，参与内皮细胞损伤的活动，并聚集炎性细胞，促进炎性递质的释放[13]。TNF-α水平越高，则AS病症越严重。周畅等[14]用虎杖苷灌胃动脉粥样硬化小鼠后，显著提高了小鼠血管的抗氧化能力。本研究中，投喂高脂食物的ApoE-/-小鼠血清中hs-CRP、TNF-α和IL-6水平均显著升高，而以虎杖苷治疗后，其含量均显著下降，提示虎杖苷对患有AS的小鼠有降脂和降低炎症反应的作用。SOD能清除自由基，抗氧化，降低脂质过氧化物的含量[15]。模型组小鼠血清中T-AOC和MDA显著升高，SOD含量则显著降低，可能是由于体内过多的自由基消耗了SOD。以虎杖苷治疗后，SOD含量升高，T-AOC和MDA含量降低，显著提高抗氧化能力，内皮功能显著提高。趋化因子MCP-1与AS的形成以及斑块的稳定性息息相关，可为动脉粥样硬化的诊断依据[16-18]。本研究中，实验组小鼠血清中MCP-1含量显著降低，动脉粥样硬化的程度逐渐缓解。在AS初期，吸烟、高血压、高血脂等刺激可以激发内皮损伤和功能障碍，并激发炎性反应。内皮细胞激活导致ICAM-1和VCAM-1等黏附因子增加。ICAM-1和VCAM-1调节白细胞在血管中的黏附能力，更加促进内皮的损伤。在正常血管中，ICAM-1和VCAM-1的含量非常低，而在AS形成的早期，ICAM-1和VCAM-1含量升高，与AS的病变程度有关[19-20]。实验组小鼠经过虎杖苷治疗后，ICAM-1和VCAM-1含量显著降低，有效缓解内皮功能的损伤。

综上所述，虎杖苷通过降低血管中脂质的含量，降低炎性细胞因子水平，调节黏附因子和趋化分子，达到对脂质代谢紊乱造成AS的小鼠降血脂和降低血管炎症反应的作用，提高内皮血管功能，有效减缓甚至防止AS的发展。

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（收稿日期：2017-12-27 本文编辑：祁海文）