以大黄素为声敏剂介导声动力疗法对小鼠动脉粥样硬化治疗作用的研究

王立民 刘有旺 王恩波 闫兆龙 李雅林

摘 要：目的 探讨以大黄素为声敏剂介导声动力疗法对小鼠动脉粥样硬化治疗作用。方法 高脂饮食诱导ApoE-/-小鼠发生动脉粥样硬化。将50只ApoE-/-小鼠分为不做任何处理的模型对照组、以5-氨基酮戊酸介导的阳性对照组、大黄素高、中、低剂量介导SDT组，每组 10只。除模型组外，其余各组自高脂4周起，分别进行相应的声动力治疗，隔天1次，于12周处死小鼠。取心脏，制备切片，通过油红染色检测斑块大小。取主动脉，进行荧光定量PCR检测基质金属蛋白酶TMP-2、TMP-9和TIMP-1，分析对斑块稳定性的影响。同样检测细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-10和TGF-β，分析对炎症的影响。结果 大黄素介导声动力疗法能减轻动脉粥样硬化斑块大小；显著增加TIMP-1而降低TMP-2和TMP-9在主动脉的表达。显著降低促炎性细胞因子TNF-α和IFN-γ而增加抗炎性细胞因子IL-10和TGF-β在主动脉局部的表达。结论 大黄素介导声动力疗法可能通过降低炎症反应发挥抗动脉粥样硬化作用，该方法对于动脉粥样硬化的治疗具有积极意义。

关键词：大黄素；声敏剂；声动力疗法；动脉粥样硬化

中图分类号：R364.1 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.06.019

文章编号：1006-1959（2018）06-0058-03

Study on the Effect of Emodin on the Treatment of Atherosclerosis in Mice

WANG Li-min，LIU You-wang，WANG En-bo，YAN Zhao-long，LI Ya-lin

（Taishan Medical College，Tai'an 271000，Shandong，China）

Abstract：Objective To investigate the therapeutic effect of emodin as a sonodynamic therapy on atherosclerosis in mice.Methods High fat diet induced atherosclerosis in ApoE-/- mice.50 ApoE-/- mice were divided into a model control group without any treatment，a 5- positive control group mediated by aminolevulinic acid，a large emodin，a medium and low dose SDT group，10 rats in each group.In addition to the model group，other groups were given fat 4 weeks，respectively，sonodynamic treatment，the next day 1， mice were sacrificed at 12 weeks.The heart was taken， the slices were prepared，and the size of the plaque was detected by oil and red staining.The aorta was taken and the matrix metalloproteinases TMP-2，TMP-9 and TIMP-1 were detected by fluorescence quantitative PCR，and the effect of the analysis on the stability of plaque was analyzed.The effects of cytokine TNF-α，IFN- gamma，IL-10 and TGF-β on the inflammation were also detected.Results Rhubarb mediated photodynamic therapy could reduce the size of atherosclerotic plaque，significantly increase TIMP-1 and reduce the expression of TMP-2 and TMP-9 in the aorta.The expression of anti-inflammatory cytokine TNF-α and IFN- gamma was significantly increased and the expression of anti-inflammatory cytokine IL-10 and TGF-β in the aorta was increased.Conclusion Emodin-mediated sonotherapy may play an anti-atherosclerotic role by reducing inflammatory response，which has a positive significance for the treatment of atherosclerosis.

Key words：Emodin；Sound sensitizer；Sonodynamic therapy；Atherosclerosis

動脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是导致心脑血管疾病最重要的危险因素。尽管临床上通过应用他汀类药物降低血脂来防治动脉粥样硬化有一定疗效，但效果并不十分理想。声动力疗法（sonodynamic therapy，SDT）利用超声对组织的较强穿透能力，以声敏剂介导超声对动脉粥样硬化进行治疗，具有较好的应用前景[1]。但开发合适的声敏剂来介导SDT是一个急需解决的问题。国内一些研究证明从大黄中提取的大黄素在抗炎、稳定AS斑块等方面具有良好的效果。本研究拟以大黄素为声敏剂，介导SDT治疗小鼠动脉粥样硬化，观察疗效并探讨可能的机制。

1 材料与方法

1.1动物与试剂 健康雌性ApoE-/-小鼠，50只，鼠龄 7周龄，体重18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。大黄素购自陕西西安森弗生物技术有限公司。油红O，购自Sigma公司。反转录试剂盒及SYBR荧光定量PCR试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。引物为自行设计，由上海生工生物工程有限公司合成。高脂饲料（21.32%脂肪，0.15%胆固醇）购自北京科澳协力饲料有限公司。

1.2方法

1.2.1动物分组及处理 所有ApoE-/-小鼠适应性喂养1周后，随机将小鼠分为不做任何处理的模型对照组、以5-氨基酮戊酸介导的阳性对照组、大黄素高、中、低剂量介导SDT组，每组 10只。模型組只进行高脂饮食12 周。从高脂第4周起，阳性对照组每隔1 d静脉注射60 mg/kg 5-氨基酮戊酸2 h后，进行声动力治疗[2]。大黄素高、中、低剂量介导SDT组静脉分别注射大黄素30、60和90 mg/kg 2 h后，进行声动力治疗。声动力治疗每次声强为1.5 W/cm2，持续时间15 min，持续8周。

1.2.2心脏冷冻切片 用PBS进行心脏灌注，待肝脏颜色变白后，取小鼠的心脏，用OCT包埋后，用冷冻切片机进行冷冻切片，厚度为5 μm。留取主动脉根部大约30～40张切片用于后续实验。用4%多聚甲醛固定15 min，储存于-80 ℃备用。

1.2.3油红染色及斑块大小统计[3] 每只小鼠取10张主动脉根部切片，切片平衡至室温后，用PBS冲洗2～3遍，60%异丙醇分色2 s；油红O室温染15 min；再用60%异丙醇分色3～5 s；苏木素染色40 s， 甘油-水封片剂封片。图像采集采用Nikon Labophot 2 显微镜及Spot RT3 彩色数码相机。斑块的定量分析采用双盲法，用Image-Pro Plus software 6.0进行斑块大小计算，每只小鼠取10张切片的平均值作为斑块大小。

1.2.4荧光定量PCR检测基质金属蛋白酶及细胞因子 按上述方法进行心脏灌注，取主动脉进行RNA提取，取2 μg总RNA，采用反转录试剂盒进行反转录，然后采用SYBR试剂盒进行荧光定量PCR检测[3]。基质金属蛋白酶TMP-2、TMP-9和TIMP-1，细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-10和TGF-β检测。

1.3统计学分析 采用SPSS 17.0软件系统进行分析，实验数据用（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为具有统计学意义，P<0.01表示差异有显著的统计学意义。

2 结果

2.1大黄素介导声动力疗法能减轻动脉粥样硬化斑块大小 为了检测大黄素介导声动力疗法对动脉粥样硬化斑块大小的影响，我们对主动脉根部的冷冻切片进行了油红染色，并进行了斑块面积的计算。与模型组比较，5-氨基酮戊酸介导的阳性对照组及SDT低、中、高剂量组斑块面积和斑块面积/官腔面积比值均显著性降低，且具有剂量-效应依赖关系（P<0.05，P<0.01，表 1）。本结果表明，大黄素介导声动力疗法能减轻动脉粥样硬化斑块大小，具有较好的治疗动脉粥样硬化的作用。

2.2大黄素介导声动力疗法具有稳定动脉粥样硬化斑块的作用 为了检测大黄素介导声动力疗法对斑块稳定性的影响，我们采用荧光定量PCR方法检测了主动脉局部与斑块稳定性有关的基质蛋白酶家族（MMPs）和金属蛋白酶组织抑制因子（，TIMP）的表达。MMPs可以通过促进血管壁细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的破坏来使AS斑块变得不稳定[4]，TIMP是其内源性的抑制剂。与模型组比较，5-氨基酮戊酸介导的阳性对照组及SDT低、中、高剂量组主动脉局部TIMP-1的表达显著升高，而TMP-2和TMP-9的表达均显著性降低且具有剂量-效应依赖关系（P<0.05，P<0.01，表 2）。本结果表明，大黄素介导声动力疗法具有稳定动脉粥样硬化斑块的作用。

2.3大黄素介导声动力疗法可能通过降低炎症反应发挥抗动脉粥样硬化作用 为了探讨大黄素介导声动力疗法抗动脉粥样硬化的可能机制，我们检测了促炎性和抗炎性细胞因子的表达。与模型组比较，5-氨基酮戊酸介导的阳性对照组及SDT低、中、高剂量组促炎性细胞因子TNF-α和IFN-γ在主动脉局部的表达显著降低，而抗炎性细胞因子IL-10，TGF-β的表达显著升高，且具有剂量-效应依赖关系（P<0.05，P<0.01，表3）。本结果表明，大黄素介导声动力疗法可能通过降低炎症反应发挥抗动脉粥样硬化作用。

3 讨论

动脉粥样硬化是一种常见的慢性炎症性心血管疾病，其中动脉粥样硬化斑块的破裂是急性心血管事件发生的主要原因，严重威胁人类健[3]。传统的动脉粥样硬化治疗包括药物治疗和手术介入治疗，是目前临床患者的主要选择。然而，这些疗法仍存在一些副作用，例如抗血小板药物治疗会引起血小板含量过低，最终导致出血；抗血脂药会导致肌病；手术介入治疗则存在机械创伤大、术后再狭窄率高、支架内血栓发生率高的缺陷[3]。因此，寻求一种损伤小、靶向性强、副作用小的动脉粥样硬化治疗方法势在必行。声动力治疗是一种无创、安全的治疗方式，其在动脉粥样硬化治疗中具有潜在的应用前景[5]。

声动力治疗中使用的药物为声敏剂，是影响其疗效的主要因素之一。大黄素是一种羟基蒽醌的衍生物，在抗炎、抗纤维化、清除自由基等方面具有良好的效果。大黄素可以干预大鼠动脉粥样硬化斑块的形成[6]。另有研究报道，大黄素具有稳定小鼠斑块的作用[4]。大黄素作为声敏剂，是否可以通过声动力疗法发挥抗动脉粥样硬化作用，却鲜有报道。

本次研究结果表明，大黄素介导声动力疗法可以显著降低动脉粥样硬化斑块大小，具有与已知阳性对照声敏剂5-氨基酮戊酸介导声动力疗法相似的疗效[2]。为了检测该方法对斑块稳定性的影响，我们检测了与斑块稳定性有关的MMP-2、MMP9和TIMP-1。MMP-2和 MMP-9是 AS斑块中 MMPs的主要成分，与AS斑块稳定性关系密切[4]。 MMP-2的主要底物包括明胶 Ⅳ（粥样斑块基底膜纤维帽的主要组成部分）、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原，弹性 蛋白及纤维连接蛋白等。MMP-9的底物包括明胶Ⅳ、Ⅴ型胶原和弹性蛋白[4]。TIMP-1是MMP的内源性抑制因子，降低斑块局部MMPs而升高TIMP-1的表达，可以增强斑块稳定性及预防斑块的破裂，对降低心血管疾病的致残率及致死率有非常重要的意义。本研究观察到经过大黄素介导声动力疗法干预之后，小鼠动脉粥样硬化斑块中的MMP-2、MMP-9表达降低，其内源性的抑制因子TIMP-1表达升高。表明该方法可以通过下调斑块中MMP-2、MMP-9的表达，上调 TIMP-1的表达，在一定程度上改变斑块的组织学构成，发挥稳定 动脉粥样硬化斑块的作用。

为了探讨该方法的作用机制，我们检测了促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的在动脉局部的表达，结果发现SDT低、中、高剂量组促炎性细胞因子TNF-α和IFN-γ在主动脉局部的表达显著降低，而抗炎性细胞因子IL-10，TGF-β的表达显著升高。说明大黄素介导声动力疗法可能通過降低炎症反应发挥抗动脉粥样硬化作用。本研究为初步探讨大黄素作为声敏剂介导声动力疗法治疗动脉粥样硬化，虽然结果较理想，但仍有待于用更经典的方法如免疫组化进行进一步验证某些实验结果。

本研究结果为采用大黄素介导声动力治疗动脉粥样硬化提供了重要的实验依据和理论基础。对于防治急性心血管临床事件具有潜在应用价值。

参考文献：

[1]寇佳媛，姜月晴，田野.中药提取物声敏剂在声动力治疗动脉粥样硬化中的应用[J].上海大学学报，2016，22（3）：318-325.

[2]Li Z，Sun X，Guo S，et al.Rapid stabilisation of atherosclerotic plaque with 5-aminolevulinic acid-mediated sonodynamic therapy[J].Thrombosis and haemostasis，2015，114（4）：793-803.

[3]Li Y，Liu X，Duan W，et al.Batf3-dependent CD8α+ Dendritic Cells Aggravates Atherosclerosis via Th1 Cell Induction and Enhanced CCL5 Expression in Plaque Macrophages[J].EBioMedicine，2017（18）：188-198.

[4]白文武，刘运芳，鹿晓婷.大黄素稳定小鼠动脉粥样硬化斑块的机制[J].中国老年学杂志，2011，31（7）：1167-1169.

[5]Guo S，Sun X，Cheng J，et al.Apoptosis of THP-1 macrophages induced by protoporphyrin IX-mediated sonodynamic therapy[J].Int J Nanomedicine，2013（8）：2239-2246.

[6]张翔，江兴林，周利玲，等.大黄素对大鼠动脉粥样硬化形成的干预及对血清 T-AOC、 SOD 和 MDA 水平的影响[J].新中医，2015，47（12）：230-231.

收稿日期：2017-9-12；修回日期：2017-9-25

编辑/成森